[发明专利]一种巢式PCR检测试剂盒及其在黄栌枯萎病菌检测中的应用

权利要求书

1.一种巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)用于第一轮PCR扩增的引物P1和引物P2；

(2)用于第二轮PCR扩增的引物PN1和引物PN2；

其中，在以黄栌枯萎病菌(Verticillium dahliae)基因组DNA作为模板进行PCR扩增时，所述引物P1在与所述引物P2配对作为引物时具有与如SEQ ID NO.1所示的引物序列相同的作为引物的功能；在以黄栌枯萎病菌(Verticillium dahliae)基因组DNA作为模板进行PCR扩增时，所述引物P2在与所述引物P1配对作为引物时具有与如SEQ ID NO.2所示的引物序列相同的作为引物的功能；并且

在以黄栌枯萎病菌(Verticillium dahliae)基因组DNA作为模板进行PCR扩增时，所述引物PN1在与所述引物PN2配对作为引物进行PCR扩增时具有与如SEQ ID NO.3所示的引物序列相同的作为引物的功能，所述引物PN2在与引物PN1配对作为引物进行PCR扩增时具有与如SEQ ID NO.4所示的引物序列相同的作为引物的功能。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：

所述引物P1为能够以所述黄栌枯萎病菌基因组DNA为模板与所述引物P2配对作为引物通过PCR扩增出第一轮扩增产物，并且所述引物P2为能够以所述黄栌枯萎病菌基因组DNA为模板与所述引物P1配对通过PCR扩增出所述第一轮扩增产物；其中，所述第一轮扩增产物为由SEQ ID NO.1所示序列和SEQ ID NO.2所示序列配对作为引物并以所述黄栌枯萎病菌基因组DNA为模板通过PCR扩增得到的序列；所述引物PN1能够以所述第一轮扩增产物为模板与所述引物PN2配对作为引物通过PCR扩增出第二轮扩增产物，并且所述引物PN2能够以所述第一轮扩增产物为模板与所述引物PN1配对通过PCR扩增出所述第二轮扩增产物；其中，所述第二轮扩增产物为由SEQ ID NO.3所示序列和SEQ ID NO.4所示序列配对作为引物并以所述第一轮扩增产物为模板通过PCR扩增得到的序列；

优选的是，所述引物P1包含如SEQ ID NO.1所示的序列，更优选为由SEQ ID NO.1所示的序列组成；和/或所述引物P2包含如SEQ ID NO.2所示的序列，更优选为由SEQ ID NO.2所示的序列组成；和/或所述引物PN1包含如SEQ ID NO.3所示的序列，更优选为由SEQ IDNO.3所示的序列组成；和/或所述引物PN2包含如SEQ ID NO.4所示的序列，更优选为由SEQID NO.4所示的序列组成。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：

(3)PCR反应缓冲液；

(4)dNTPs；

(5)Taq酶；

(6)无菌水。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述PCR反应缓冲液为10倍PCR扩增用浓度；更优选的是，所述PCR反应缓冲液含有Tris-HCl、MgCl₂和KCl；优选的是，所述PCR反应缓冲液的组成如下：100mM的pH为8.3的Tris-HCl缓冲液、15mM MgCl₂和500mM KCl。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：

所述dNTPs是浓度不低于2.5mmol/L的dNTPs混合液；

所述Taq酶是浓度不低于5U/μL的Taq酶溶液；

所述引物P1、P2、PN1和PN2各自独立地为浓度不低于10μmol/的引物溶液。

6.权利要求1至5中任一项所述的试剂盒在检测黄栌枯萎病菌(Verticilliumdahliae)中的应用。

7.一种检测黄栌枯萎病菌的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1至5中任一项所述的试剂盒进行检测。