[发明专利]一种从人体血液中性粒细胞的嗜天青颗粒中分离纯化天然蛋白酶3的方法

说明书

本发明提供了一种从人体血液中性粒细胞的嗜天青颗粒中分离纯化天然蛋白酶3的方法，步骤包括：使用从人体输血后废弃医疗用品中回收并提取的中性粒细胞嗜天青颗粒,经研磨，溶解，离心后获得含有蛋白酶3的层析过柱起始蛋白溶液，结合阳离子交换层析柱，染色配体层析柱，分子筛层析柱以及亲和层析柱等纯化方法从人体血液中性粒细胞嗜天青颗粒中分离、纯化天然蛋白酶3。采用上述方法制备得到的天然蛋白酶3在产量、纯度、活性、特异性以及稳定性上均有大幅度的提高，其高质量更适用于科学研究以及医学检测。

技术领域

本发明涉及医学检测产品技术领域，具体涉及一种从人体血液中性粒细胞的嗜天青颗粒中分离纯化天然蛋白酶3的方法。

背景技术

抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)是在坏死性小血管炎中发现的。这些抗体大部分属于IgG类型，在乙醇固定的中性粒细胞和单核细胞的间接免疫荧光反应中有很明显的阳性反应，它们其中一个主要靶点是蛋白酶3(PR3)抗原(即是所谓的胞浆型cANCA)。抗蛋白酶3(PR3)特异性抗体是中性粒细胞特异性自身抗体相关脉管炎疾病，特别是韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)的一种敏感的和特异性的标记物，可辅助临床医生诊断各种系统性炎症疾病。该抗体在活动性韦格纳肉芽肿病(GPA)以及全身性血管炎患者中的特异性大于90％。抗蛋白酶3(PR3)抗体阳性也可见于少数多动脉炎(MPA)，Chung-Strauss综合征(CSS)，结节性多动脉炎(PAN)少数巨细胞动脉炎，过敏性紫癜，白细胞破碎性皮肤血管炎和白塞氏病等。目前中性粒白细胞间接免疫荧光检测(IIF)和标准化的抗蛋白酶3(PR3)抗体ELISA检测相结合的检测方法被广泛适用于以上疾病的检测。抗蛋白酶3(PR3)抗体在临床上另一重要应用价值在于该抗体效价与病情活动一致，在GPA等原发性血管炎患者常被作为判断疗效、估计复发的指标，从而指导临床治疗。对抗蛋白酶3(PR3)抗体进行高灵敏度，高准确性的检测，需要诊断试剂中的核心原料蛋白酶3(PR3)抗原具备高纯度，高活性，高特异性等特质，来避免检测结果中可能出现的假阳性，假阴性。这对蛋白酶3(PR3)抗原的制备提出了很高的要求。

目前市场中，用于检测产品开发的抗原原料主要分为重组表达和天然提取两个来源。相对于利用宿主细胞表达出的重组抗原，从人体血液细胞中提取并纯化的天然抗原具备诸多优势，包括：高度的氨基酸序列同源性，天然的蛋白质三级以及四级构象，正确的人血细胞翻译后修饰过程(如磷酸化，糖基化等)，以及完整的蛋白功能表达所需的抗原受体和抗原表位等。同时，天然抗原不存在重组抗原通常都有的聚集和溶解度的问题，可以更加良好充分的和其特异性抗体相结合，从而降低检测的差异性。然而由于天然蛋白的资源有限,来源各异,导致大规模，批量提取天然抗原具有一定难度,且成本昂贵。

过去的文献中介绍天然蛋白酶3(PR3)纯化的方法主要是常规的色谱层析法，通常以嗜中性粒细胞的全细胞裂解液作为初始粗蛋白液。但是全细胞裂解液含有大量的细胞杂蛋白，需要复杂的后续色谱层析分离、纯化步骤。

成功纯化蛋白酶3的较早报道出现在上世纪80年代。1988年，J Clin Invest.82(6):1963-73，Proteinase 3.A distinct human polymorphonuclear leukocyteproteinase that produces emphysema in hamsters，by Kao RC,Wehner NG et.al.简单粗略的介绍了蛋白酶3的纯化方法.

1992年，ANCA-Associated Vasculitides:Immunological and ClinicalAspects，1(1)：56-58,Proteinase 3:Substrate Specificity and PossiblePathogenetic effect of Wegener’s Granulomatosis Autoantibodies(c-ANCA)byDysregulation of the enzyme，by Wolfgang L.Gross沿用了过去使用染料配体亲和层析法，初步分离白细胞颗粒并提取纯化蛋白酶3的方法。此方法产生蛋白纯度较低。