[发明专利]稻瘟病菌孢子实时定量环介导等温扩增检测法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于稻瘟病菌的q‑LAMP快速检测方法的LAMP特异性引物组合物以及包含该LAMP特异性引物组合物的用于定量检测稻瘟病菌的环介导等温扩增试剂盒；本发明还同时公开了一种用于定量检测稻瘟病菌的环介导等温扩增方法，包括以下步骤：一、进行LAMP反应；二、判断：以荧光信号作为结果判定依据，当荧光值大于50时，判定结果为阳性，即待测样品中含稻瘟病菌DNA；反之，当荧光信号小于50时，判定结果为阴性，即待测样品中无稻瘟病菌DNA。本发明具有特异性强、鉴定快速的技术优势。

技术领域

本发明涉及一种稻瘟病的实时定量环介导等温扩增(q-LAMP)检测方法及试剂盒，属于植物病害检测、鉴定及防治的早期预警技术领域。

背景技术

稻瘟病(rice blast)是由稻瘟病菌[Magnaporthe grisea(Hebert)Barr.]引起的真菌性病害。稻瘟病是目前对水稻生产危害最大的流行性真菌病害，给水稻产量带来巨大的损失。稻瘟病在水稻的不同组织部位和不同生育期均能发生，可侵染水稻叶片、茎节、穗颈和谷粒，其中穗颈瘟对稻谷产量的影响最大。在稻瘟病流行年份，田间损失轻则减产10～20％，重则减产40～50％，甚至颗粒无收。近些年，我国东北、西南及长江中下游等重要水稻种植地区连续发生，全国发病总面积高达330～570万hm²，稻米减产数亿吨，在稻瘟病流行的年份甚至失去收获价值，己给我国水稻的安全生产及提高粮食作物产量带来了巨大的压力。

稻瘟病菌的初侵染主要主要来自病谷和病稻草。在自然界，稻瘟病菌主要依靠无性态的分生孢子进行侵染。翌年当气温上升到20℃左右并且遇到降雨时，就能不断产生分生孢子。夜间12时至次日凌晨6时产生的孢子最多。当稻瘟病菌接触水稻后，在适宜条件下发生以下的侵染过程：(1)病菌的分生孢子接触水稻叶表面后，其尖端释放的粘胶以及形成的芽管使孢子紧密地粘着在水稻叶表面；(2)芽管分化成特殊的侵染机构附着胞；(3)附着胞产生侵染丁穿透附着胞小孔和植物表面；(4)病菌分化成次生菌丝在寄主细胞中生长，并侵染邻近表皮细胞和深入叶肉细胞；(5)5～7d后出现症状，分生孢子梗产生大量的新的分生孢子，并且从病斑中释放出来；(6)新形成的分生孢子再次侵染寄主。后期以菌丝体和分生孢子在病谷和病稻草上越冬，完成侵染循环。

实时监测稻瘟菌的菌源量并结合栽培品种和天气等发病条件，把握好病害防治适期，可以有效控制该病害的发生与流行。常规植物病害的流行监测多为根据发病症状进行发病率、病情级数调查或镜检捕捉的气传孢子样品以确定病原菌群体数量的变化，但是这些传统方法受个人主观因素影响较大，需要专业技术人员进行操作，且费时费力。实时q-PCR技术可以实现对病原菌的定量检测，但是该检测方法对受检样品的要求高，难以对粗提的复杂样品DNA进行准确定量。因此，开发出一种灵敏度高、操作简便、成本低廉且能对空气中和植物组织中病原菌进行定量的检测体系显得尤为重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一套用于实时定量检测稻瘟病菌的环介导等温扩增引物组合物和以及含有该引物的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测稻瘟病菌的q-LAMP引物组合物，由上下游外引物，上下游内引物四条引物组成，引物序列如下：

上游外引物(F3)：5’—GGAACTTGTAGCACTCGGC—3’；

下游外引物(B3)：5’—TGGTGGCGGTTATGAGAGG—3’；

上游内引物(FIP)：5’—TGGGGTTGTTGCTGCTGCTGCAAGAGAAACCCACCGCATC—3’；

下游内引物(BIP)：5’—CACAACCAGCCCAAAAGCCCGGGGTTTGGTGAGGAACTC—3’。