[发明专利]稻瘟病菌孢子实时定量环介导等温扩增检测法及试剂盒在审
| 申请号： | 201810452708.9 | 申请日： | 2018-05-13 |
| 公开（公告）号： | CN108588184A | 公开（公告）日： | 2018-09-28 |
| 发明（设计）人： | 张传清;张书亚;李玲;吴鉴艳;张宇;朱国念 | 申请（专利权）人： | 浙江农林大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6844 | 分类号： | C12Q1/6844;C12Q1/6895;C12Q1/06;C12N15/11;C12R1/645 |
| 代理公司： | 杭州中成专利事务所有限公司 33212 | 代理人： | 金祺 |
| 地址： | 311300 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 稻瘟病菌 环介导等温扩增 特异性引物组合 待测样品 定量检测 判定结果 荧光信号 试剂盒 环介导等温扩增检测 稻瘟病菌孢子 技术优势 结果判定 快速检测 实时定量 特异性强 阴性 荧光 | ||
1.用于稻瘟病菌的q-LAMP快速检测方法的LAMP特异性引物组合物，其特征在于：所述LAMP特异性引物组合物由上下游外引物、上下游内引物这四条引物组成；
上游外引物(F3)：5’—GGAACTTGTAGCACTCGGC—3’；
下游外引物(B3)：5’—TGGTGGCGGTTATGAGAGG—3’；
上游内引物(FIP)：5’—TGGGGTTGTTGCTGCTGCTGCAAGAGAAACCCACCGCATC—3’；
下游内引物(BIP)：5’—CACAACCAGCCCAAAAGCCCGGGGTTTGGTGAGGAACTC—3’。
2.用于定量检测稻瘟病菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1所述的LAMP特异性引物组合物。
3.根据权利要求2所述的用于定量检测稻瘟病菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含10×ThermoPol Buffer、1mmol/L dNTPs、4mmol/L MgCl2、0.6mmol/L甜菜碱、10×SYBR Green I、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH2O。
4.用于定量检测稻瘟病菌的环介导等温扩增方法，其特征在于依次进行以下步骤：
一、进行LAMP反应：
LAMP反应体系为20μL，
其中，8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl2 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、10×SYBR Green I 1μL、待测菌DNA模板1μL，双蒸水补足至20μL；
扩增条件为63.4℃，1min，60个循环；80℃反应10min，终止反应；
二、判断：
以荧光信号作为结果判定依据，当荧光值大于50时，判定结果为阳性，即待测样品中含稻瘟病菌DNA；
反之，当荧光信号小于50时，判定结果为阴性，即待测样品中无稻瘟病菌DNA。
5.根据权利要求4所述的环介导等温扩增方法，其特征在于：定量线性回归方程为y＝-0.3066x+15.33，其中为y为稻瘟病菌孢子数对数值，x为扩增反应时间(分钟)；孢子数量(个)计算公式为100.60y。
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