[发明专利]一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法

说明书

本发明公开一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法，包括以下步骤：采用粘膜下层制备口腔补片，通过传代培养法培养口腔粘膜上皮细胞，将口腔粘膜上皮细胞接种至放有口腔补片的细胞培养皿中，37℃，5%CO₂细胞培养箱中培养，培养终止后即得到复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片。本发明所提供的一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法，材料来源充分，能够使口腔粘膜上皮细胞在口腔补片中大量增殖，为临床上口腔粘膜大面积缺损的修复重建提供新的途径。

技术领域

本发明涉及一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法，属于细胞生物技术领域。

背景技术

口腔粘膜作为人体生物性屏障的第一道防线，在日常生活中发挥着至关重要的作用，但口腔粘膜的位置及其周围环境导致多种因素可引起口腔粘膜组织缺失，如口腔颌面外科的肿瘤切除，创伤及修复前的牙槽外科往往有大面积口腔粘膜缺损，临床上常以皮片移植或皮瓣转移修复，但皮片移植常因挛缩导致口腔狭窄、影响功能，局部皮瓣转移则常致局部臃肿，形态不佳，患者难以接受。而且，自体组织移植是以牺牲正常组织为代价的“以创伤修复损伤”的治疗模式，既增加了新的创伤，又增加了手术并发症的机率，且自体组织来源有限，限制了其临床应用。并且对于较大面积的口腔粘膜缺损仍然具有较大的局限性，很难达到预期的治疗效果，所以寻找简便、安全、有效的口腔粘膜修复材料已成为治疗口腔粘膜疾患，提高患者生存质量的关键。

随着生物材料的兴起，临床上口腔粘膜缺损修复取得较为满意的治疗效果，目前口腔粘膜缺损修复临床方法是采用在口腔粘膜修复材料种植上皮细胞后，将可降解的材料和上皮细胞缝合回患者的缺损部位，以促进患者口腔粘膜的修复。这一方法面临两大技术难点：首先原代上皮细胞贴壁效果差，同时由于人口腔黏膜组织标本来源有限导致可供增殖细胞的数量不足，在细胞培养过程中还有一定程度的细胞损伤，也是本实验中多数上皮细胞原代培养失败的重要原因。所以需要良好的细胞培养支架提高口腔粘膜上皮细胞的培养效果。

组织工程学是一门新兴的学科，它应用细胞生物学和工程学的原理，研究和开发能修复损伤组织和改善其功能的生物替代物，通过少量组织细胞体外培养扩增后构建具有生命力的活体组织，达到修复组织缺损的目的。目前典型的生物可吸收材料是生物可降解的高分子聚合物分天然的和合成的两大类，其中天然高分子材料有多聚糖类（壳聚糖、透明胶质酸、藻酸盐类、淀粉）、蛋白类（胶原蛋白、丝素蛋白、）和微生物来源聚脂类（聚羟基脂肪酸脂、聚3—羟基丁酸脂）等。虽然天然高聚物具有可降解性且毒性低、但溶解或降解太快、生物性能不稳、免疫排斥及传染疾病等缺点。而合成生物可降解聚合物有聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚乙醇乙酸(PGA)等，具有细胞黏附力弱．不利于细胞附着的缺点，导致口腔上皮细胞会聚集在生物支持材料的某个区域，培养的细胞分布不均匀，所以较少作为细胞支架材料。

而粘膜下层（small intestinal submucosa，SIS）是天然细胞外基质类生物衍生材料，它是由一层致密的结缔组织构成，主要含有Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白，无免疫原性，具有抗微生物活性，有良好的生物力学性能和生物相容性。SIS携带多种生长因子如FGF-2、CTGF、TGF-b等，可促进多种细胞在材料上黏附、生长和分化，并能促进组织再生，是一种良好组织工程的生物支架材料。

运用组织工程技术，将口腔粘膜上皮细胞作为种子细胞种植在支架材料上，构建有活性的口腔粘膜修复材料，为临床上口腔粘膜缺损修复重建提供新的途径。

发明内容

本发明所解决的技术问题是：1）口腔上皮细胞培养困难，难以获得口腔修复手术量的上皮细胞。2）口腔缺损患者因口腔颌面外科的肿瘤切除，创伤及修复前的牙槽外科手术等所造成的大面积口腔粘膜缺损，难以得到有效地修复及重建。

为解决上诉技术问题，本发明提供了一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法，材料来源充分，同时口腔补片中含有多种生长因子，可以促进口腔粘膜上皮细胞在口腔补片中大量增殖，解决临床上口腔粘膜大面积缺损的修复重建的难题。包括以下步骤：