[发明专利]一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法

权利要求书

1.一种复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1.1） 口腔补片的制备：采用粘膜下层制备口腔补片，步骤为取材于猪粘膜下层，经去细胞、去DNA、病毒灭活、冻干和辐照灭菌等加工过程后获得；

1.2） 口腔粘膜上皮细胞的原代培养：用Dispase II酶消化获得手术病人口腔上皮层后，对其用消化酶消化，获得一定密度口腔上皮细胞后进行培养；

1.3） 口腔粘膜上皮细胞的传代培养：对步骤1.2中获得口腔上皮细胞进行传代培养至一定代数和密度；

1.4） 口腔粘膜上皮细胞与口腔补片复合培养：将步骤1.3中获得的口腔上皮细胞接种在步骤1.1中的口腔补片上，培养至特定密度，即获得复合口腔粘膜上皮细胞的口腔补片，可移植到口腔粘膜受损区，并缝合固定。

2.如权利要求1所述的口腔补片制备方法，其特征在于，粘膜下层为小肠粘膜、胃粘膜下层、膀胱粘膜下层的一种或多种。

3.如权利要求1所述的口腔补片制备方法，其特征在于，所述口腔粘膜上皮细胞的原代培养步骤为：无菌条件下于手术病人口腔内获取口腔黏膜组织；用含双抗的生理盐水反复冲洗，再用PBS液冲洗；用眼科剪除去黏膜下组织，剪成约5mm×5 mm的小块，放入培养皿内，加入含0.25％DispaseⅡ的DKSFM培养基并没过组织块， 4℃消化16～18h，将表层上皮与上皮下层用眼科镊分开，上皮层加入消化酶37℃消化15min（5 min 吹打振动1次），加FBS液终止消化；

用吸管吹打成单细胞悬液；经200目不锈钢网过滤，离心，弃上清，PBS液清洗3次，经细胞计数后，按每毫升1×10⁵个细胞接种于细胞培养皿内，加入培养液3～5ml，置37℃、5%CO₂饱和湿度细胞培养箱中培养，第3天开始首次换液，以后每2天换液1次。

4.如权利要求1所述的口腔补片制备方法，其特征在于，所述口腔粘膜上皮细胞的传代培养步骤为：倒置相差显微镜下观察，当口腔粘膜上皮细胞铺满培养皿底2/3以上时，弃掉旧培养液；4 ℃ PBS清洗 3次，加入消化酶37 ℃消化，倒置相差显微镜下见大部分细胞变圆脱壁后，加入培养液终止消化，用弯头吸管反复吹打，形成细胞悬液，离心，弃上清；加入培养液重悬细胞，经细胞计数后，按每毫升1×10⁵个细胞接种新培养皿内继续培养。

5.如权利要求1所述的口腔补片制备方法，其特征在于，所述口腔粘

膜上皮细胞与口腔补片复合培养步骤为：取步骤1.1中获得的口腔补片，放入细胞培养皿中，用DKSFM培养基浸泡1～3天后，加入6～20%的牛血清，放入37℃细胞培养箱中孵育12～16h；

取步骤1.3中传代培养的口腔粘膜上皮细胞，用含 0.02％EDTA 的消化酶消化，离心、去上清，PBS反复漂洗3次后加入培养液制成细胞悬液，将细胞悬液稀释后种至放有口腔补片的细胞培养皿中，放入37℃，5%CO₂细胞培养箱中培养，每1～3天换液1次。

6.如权利要求3所述的口腔补片制备方法，其特征在于

所述消化酶溶液包括浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液；

所述离心过程使用的转速及时间优选为800rpm，5min；

所述步骤1.2中的双抗生理盐水含有100ug/ml的青霉素与100ug/ml的链霉素；

所述步骤1.2中FBS液含有10%的FBS。

7.如权利要求3 - 5所述的口腔补片制备方法，其特征在于，所述的培养液为6 ～2 0%FBS的DKSFM培养液。

8.如权利要求1或4所述的口腔补片制备方法，其特征在于，所述步

骤1.4中所述传代培养获得的口腔粘膜上皮细胞优选为2代培养的细胞。

9.如权利要求4所述的口腔补片制备方法，其特征在于，所述步骤1.4中所述的细胞悬液的接种密度为2×10⁶～5×10⁶个/皿。