[发明专利]杀香鱼假单胞菌DNA疫苗、制备方法及其应用

权利要求书

1.一种杀香鱼假单胞菌DNA疫苗，其特征在于：该疫苗为pci-pcrV；

该疫苗以保藏编号为：CGMCC No. 8985的杀香鱼假单胞菌Pseudomonas plecoglossicida NB2011基因组DNA为模板，经引物P1/P2进行PCR扩增，扩增产物经纯化后与质粒pci-neo连接，获得重组质粒pci-pcrV，即为杀香鱼假单胞菌DNA疫苗；

所述引物序列为：

P1: 5’-ggaattcatggcaaggatcgaagagg-3’

P2: 5’-gcgtcgacctaccctaaagcggttttcag-3’；

其中靶基因pcrV为SEQ ID NO：1所示的序列，具体的为：

5’-ATGGCAAGGATCGAAGAGGTTGGAGTAAATCGTCTAGGTTCGGTGCAGGAATCAGAAGTGTCGCCGGATGCGGTGGCGAGACTGCTGAAGAGCTTGCACGAAAACAAGGTTGAACTAGTGCTGGATGGGCACAGGTTGACCGCTAAGCAGGCCGAAAAAATATTTGTAGCGCTGCTGAGTGATGGTGGCAGTGAAGGTGGCTCGCCAGACGAAAATGTGCAGGCAATCCGCAAGGCAATTCAGGGGCAGGCCGGAAAAGCCTTAGAAGTTGGTGAGTTGTTCATGCACCTGCCATCGCAGCGGCTTGATGTCATGATTATTGCGGGGTTCACTGAAATCCTTCAGGGGCAGGCCGCAAAAAAAAATAGTCAAAGTGACGAATTAAAGAGCCTGTCGGTAGAGTTGAAAATCTATAGCGTTATTCAGTCGCAAGTCAGTGCCGCGCTTGCCAAAAAAGAAGCGTTTGATATTTCGGCATCTGGCGTGAACCTGATGGATTACAAGTTGTATGGTTATACCAGCGCTGAACAGTGGGCCGGTTCAAAGGAACGCGTCTTTTTAGAAAAGCTGGATACGCATTCCCGCGAGGGCATGAGCATCAGAGAGTTTCTTGAGGGTGGGCCAAAGGAGACGGGCAAACTGAGTAACTTGCAAAACAGCTATGCTTACGAAAAGGATAATAATCCGCTCCAGAATTTCTCTACAACGCTTGCAGATCGCTCCCGGCCTCTGGGGGATAGTGTGAATGAAAAATCAGCGCAACTAAATGAGACAAACGCTCGTTATAATGCCGTGATAGATGCCTTTAGCAGGATGGTTGATAAGTTTGATAAGTTGCTGAAAACCGCTTTAGGGTAG-3’。

2.根据权利要求1所述的杀香鱼假单胞菌DNA疫苗，其特征在于：所述重组质粒pci-pcrV在磷酸盐缓冲液中稀释到终浓度为100μg/mL，作为疫苗制备液，所述疫苗为注射剂。

3.根据权利要求2所述的杀香鱼假单胞菌DNA疫苗，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液的组成成分按重量百分比为：0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.358% Na₂HPO₄·12H₂O, 0.024%NaH₂PO₄，余量为水。

4.权利要求1-3任一权利要求所述的杀香鱼假单胞菌DNA疫苗的制备方法，其特征在于：制备步骤包括：

以杀香鱼假单胞菌NB2011基因组DNA作为模板，采用引物P1/P2进行PCR扩增；

PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA，然后94℃ 45s，59℃ 45s，72℃ 45s，30个循环后在72℃终末延伸8min；

PCR产物纯化后与用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切的pci-neo质粒连接，连接液转化到大肠杆菌DH5α后在含有氨苄青霉素的LB平板上培养18-24h，挑取阳性克隆转接含氨苄青霉素的LB培养液中培养，提取重组质粒，经EcoRⅠ和Sal Ⅰ双酶切验证为获得重组质粒pci-pcrV，即为杀香鱼假单胞菌DNA疫苗。