[发明专利]一种用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌的引物探针、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌的引物探针、试剂盒及检测方法。本发明特异性检测引物探针以及含有该检测引物探针的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过RNA恒温扩增的检测方法具有灵敏度高、特异性强、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)、快速的特点，对仪器要求低，操作过程简单，适合食品企业和基层检测机构自检使用，适用于现场检测，尤其适用于奶粉快速检测和保障奶粉安全。

技术领域

本发明涉及致病菌微生物检测技术领域，具体涉及一种基于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属(CS)快速检测技术，特别涉及检测克罗诺杆菌的特异性检测引物探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

克罗诺杆菌属(Cronobacter)，原称为阪崎肠杆菌，阪崎肠杆菌是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌，属肠杆菌科。它是乳制品中近几年新发现的引起广泛关注的一种致病菌。克罗诺杆菌毒力强，能导致新生儿脑膜炎、致死性小肠结肠炎和菌血症等疾病，尽管使用抗生治疗可以康复，但伴随着严重的神经系统后遗症、发育障碍等症状，由该菌引起的感染死亡率高达50％以上。近年来，婴儿配方奶粉中污染克罗诺杆菌的报道较多，其散发和爆发的病例在全球范围内相继出现，已引起世界多国相关部门的重视。因此，快速检测婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌属，不仅能够及时有效地预防治疗相关疾病，同时也是保障人民身体健康的必要手段。

近年来，食源性致病菌的快速检测和鉴定方法发展较为迅速，以免疫学为基础的ELISA技术、免疫磁珠技术、全自动免疫酶标检测系列、免疫胶体金技术等，以分子生物学为基础的RNA指纹图谱技术、实时荧光PCR技术、基因芯片技术等，以纸片法为代表的细菌代谢为基础的酶触反应技术等，这些快速检测方法大大缩短了致病菌检验的时间，提高了检验效率，但也存在一些问题难以解决。国标培养法检测阪崎肠杆菌需要4～7天，行标实时荧光PCR法需要2～5天，实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)检测阪崎肠杆菌需要6小时，Nucleic Acid Sequence Based Amplification(NASBA)和Transcription MediatedAmplification(TMA)暂无阪崎肠杆菌相关检测试剂盒。

传统阪崎肠杆菌检测方法由于菌浓度较低且培养条件要求较高，耗费时间长、检验效率低，从而导致不能及时监控阪崎肠杆菌，不能实现现场检测。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌的引物探针、试剂盒及检测方法，实现对克罗诺杆菌的现场快速、准确检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属的引物探针，所述引物序列为：

上游引物：CTTACCAGGTGTTGACATCC；

下游引物：

AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAACATCTCAGAACACGTGCT；

所述探针为荧光探针，其序列为：

CACCGAGUGCCUUCGGGAACGGUG。

优选的，所述荧光探针5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。

本发明还提供了一种用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属的试剂盒，所述试剂盒包括含有上述技术方案所述引物探针的检测液，含有T7RNA聚合酶和M-mLV反转录酶的酶液和反应液。

优选的，所述试剂盒还包括：裂解液、核酸提取液、洗涤液、阳性对照和阴性对照。

进一步优选的，所述试剂盒中包括以下试剂组成：

(1)裂解液：10％Triton X-100，4.5～5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCI，pH8.0；