[发明专利]一种用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌的引物探针、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属的引物探针，其特征在于，所述引物序列为：

上游引物为：CTTACCAGGTGTTGACATCC；

下游引物为：

AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAACATCTCAGAACACGAGCT；

所述探针为荧光探针，其序列为：CACCGAGUGCCUUCGGGAACGGUG；

所述荧光探针5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。

2.一种用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物探针的检测液，T7RNA聚合酶，M-mLV反转录酶和反应液。

3.根据权利要求2所述用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：裂解液、核酸提取液、洗涤液、阳性对照和阴性对照。

4.根据权利要求2或3所述用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括以下试剂组成：

(1)裂解液：10％Triton X-100，4.5～5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCI，pH8.0；

(2)核酸提取液：40～200mM EDTA，50～500mg/L磁珠，1～50μΜ捕获探针；

(3)洗涤液：2～2.5mmol/L NaCl，4.5～5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCI，pH8.0，10％SDS；

(4)反应液：10mmol/L Tris HCI，40mmol/L MgCl₂，0.5～5mM dNTPs，1～10mM NTPs，2.5～2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na₂HPO₄，2mmol/L KH₂PO₄；

(5)检测液：5～15pmol/L上游引物CS nT7，5～15pmol/L下游引物CS T7，5～10pmol/LCS荧光探针，1mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA，DEPC水；

(6)酶液：500～1000U/反应M-mLV反转录酶、500～1500U/反应T7RNA聚合酶，1mmol/LTris-HCl pH8.0，2.5～2.7mmol/L KCl，1mmol/L EDTA，10％BSA；

(7)阳性对照：克罗诺杆菌属菌液；

(8)阴性对照：生理盐水。

5.一种非诊断目的的克罗诺杆菌属的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

(1)提取待检样品中的菌体RNA；

(2)利用权利要求1所述的引物探针对待检样品中的菌体RNA进行RNA恒温扩增，记录待检样品反应的ct值，根据ct值判定是否含有克罗诺杆菌属菌体RNA：FAM通道：ct≤55的样本为阳性；55＜ct＜60的样本建议重新检测，复检结果FAM通道：ct＜60的样本为阳性；

FAM通道ct无数值或为60的样本为阴性。

6.根据权利要求5所述的非诊断目的的克罗诺杆菌属的检测方法，其特征在于，所述待检样品为婴幼儿配方食品。

7.根据权利要求5所述的非诊断目的的克罗诺杆菌属的检测方法，其特征在于，所述扩增反应体系为：5～15pmol上游引物CS nT7，5～15pmol下游引物CS T7，5～10pmolCS荧光探针，10～40mM MgCl₂，0.5～5mM dNTPs，1～10mM NTPs，500～1500U T7RNA聚合酶，500～1000U M-mLV反转录酶。

8.根据权利要求5所述的非诊断目的的克罗诺杆菌属的检测方法，其特征在于，所述扩增反应条件为荧光PCR仪中42℃±0.1℃反应40～60min。

9.一种非诊断目的的克罗诺杆菌属的检测方法，其特征在于，由权利要求3或4所述的试剂盒进行检测，具体操作方法包括：

(1)用所述裂解液裂解待测样品中的菌体，得到含有菌体核酸的溶液；

(2)向步骤(1)的所述溶液中加入所述核酸提取液，使磁珠上的捕获探针与靶标RNA结合，用所述洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到菌体RNA；

(3)将步骤(2)提取得到的菌体RNA加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，在60℃±0.1℃下温育8～12min后，再在42℃±0.1℃下温育4～6min，然后加入含有

T7RNA聚合酶和M-mLV反转录酶的酶液，由此开始在42℃±0.1℃下反应40～60min，用检测仪同步记录荧光信号的变化；

(4)根据荧光信号产生的时间和强度，参照阳性对照和阴性对照结果对待测样品进行检测及判定；所述判定方法为：检测结果为阳性，则样品中有克罗诺杆菌属活菌，阴性则样品中没有克罗诺杆菌属活菌。