[发明专利]基于解旋酶检测DNA与蛋白质相互作用的方法

说明书

本发明提供一种用于检测DNA与蛋白质相互作用的方法，所述方法基于解旋酶，通过DNA分子长度的变化，确定蛋白质在发卡DNA上的结合位点。与现有技术相比，本发明的方法为单分子操作，直观反映蛋白质分子和DNA分子的相互作用；本方法的精确率很高，达到一个碱基对；本发明的方法还可以检测DNA与蛋白质的各个结合位点的结合强度的强弱；所述方法所需要的DNA和蛋白质的用量很少。

技术领域

本发明属于分子生物学研究领域，涉及一种用于检测DNA与蛋白质相互作用的方法。

背景技术

在细胞的生命活动过程中，DNA的复制与重组、RNA的转录与修饰，以及病毒的感染与增殖等等，都是涉及到特定的DNA区段与特殊蛋白质结合因子之间的相互作用。因此，长期以来人们就一直关注DNA结合蛋白的研究。蛋白质与DNA的相互作用也是分子生物学研究的中心问题之一。核酸-蛋白的互作在生命活动中发挥着广泛而重要的作用，二者的协作是各种生命现象的基础。将细胞或细胞器中的蛋白质、核酸等生物大分子的相互作用联系起来，是综合研究一个完整的生物学途径的核心内容。

有一类非组蛋白，它们能从DNA双链外部的大沟、小沟中识别碱基排列并与碱基形成氢键，从而与一段较短的特异DNA序列结合，这类蛋白质被称为序列特异性DNA结合蛋白质。它们可参与染色体构建，启动基因的复制，调控基因的转录等。这正是我们想要检测的蛋白质类型。

目前，检测序列特异性DNA结合蛋白质结合位点的方法主要有凝胶阻滞实验、染色质免疫共沉淀技术、DNaseⅠ足迹实验、甲基化干扰实验等。但这些技术方法都属于体实验，存在反应物用量大、DNA底物需要放射性标记、实验周期长等缺点。而且，传统的试验方案中常常因为DNA探针需要标记而使实验过程变得比较繁琐，同时，也存在某种程度的放射性核素污染和伤害。

具体地，凝胶阻滞试验(gel retardation assay)是用于研究DNA或RNA与蛋白质相互作用的重要实验技术之一。在凝胶实验中，传统的方法是用放射性同位素或其他生物素标记待检测的DNA片段(又称探针DNA，probe)然后与细胞蛋白质提取物一道温育，于是便形成了DNA蛋白质复合物。将其移入非变性的聚丙酰胺凝胶中，控制蛋白质与探针保持结合状态，电泳。最后借助放射性自显影技术(或其它适当技术)显现DNA条带位置。如果细胞蛋白质中不存在与探针结合的蛋白质，那么，所有DNA条带都将集中出现在凝胶底部；反之，将会形成DNA-蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的的探针-蛋白质复合物条带就将滞后出现在较靠后位置。凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞提取物中是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)，用来研究此种结合作用的DNA序列的特异性，而且还可以用于捕捉在特定条件干预下，双方结合的变化及外界干预对其变化的影响等生物信息。然而，此方法制胶过程繁琐，电泳时间长。

DNaseI足迹试验(DNaseI footFIrinting assay)是一种测定DNA结合蛋白在DNA上的准确结合位点的技术。该方法需对DNA进行单链标记，操作复杂，需要专门的检测手段。

甲基化干扰试验根据DMS能使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理而设计。其操作结束后也需要做凝胶阻滞试验，因而操作比较繁琐。

酵母单杂交技术广泛用于DNA与蛋白相互作用的研究，但其基本操作需要三个方面的过程，涉及分子生物学的大量方法，需要酵母菌作为载体。

噬菌体展示技术是一种基因表达产物和亲选择相结合的技术，核酸适体技术首先是利用现有的分子生物学技术人工合成一个含有1014～1015个单链寡核苷酸序列的随机文库，体内足迹试验原理与甲基化试验基本相同，其实质是体外甲基化试验的变种，免疫沉淀技术操作步骤更加繁琐，

因此，以上常用的研究DNA与蛋白质相互作用的方法都有一定的局限性，不能全面反映DNA与蛋白质相互作用的真实情况。

发明内容