[发明专利]基于解旋酶检测DNA与蛋白质相互作用的方法

权利要求书

1.一种基于解旋酶检测DNA与蛋白质相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：

1)根据所检测的蛋白质设计DNA分子；

其中，所述DNA分子包含发卡结构和两个双链DNA手柄，所述发卡上含有解旋酶结合位点，两个双链DNA手柄的末端分别修饰地高辛和生物素，并且所述解旋酶的解旋方向是解旋发卡DNA的方向；

2)将步骤1)得到的DNA分子与链霉亲和素修饰的顺磁性小球溶液混匀，使DNA分子修饰生物素的手柄与顺磁性小球连接，获得DNA分子与顺磁性小球的组合体；

其中，1μL 50pmol的DNA分子使用1～50μL浓度为10mg/ml的磁性小球混匀；

3)将步骤2)获得的DNA分子与顺磁性小球的组合体放入磁镊装置的样品池中，所述样品池的表面耦合抗地高辛，使得所述组合体连接到样品池的表面；利用微流泵向样品池中加入解旋酶，并对DNA分子施加6～8pN的拉力，得到第一信号；

4)将步骤2)获得的DNA分子与顺磁性小球的组合体放入磁镊装置的另一样品池中，所述样品池的表面耦合抗地高辛，使得所述组合体连接到样品池的表面；利用微流泵向样品池中加入待检测的蛋白质，然后加入解旋酶，对DNA分子施加6～8pN的拉力，得到第二信号；

5)比较第一信号和第二信号，得到蛋白质在发卡DNA上的结合位置。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1)中，两个双链DNA手柄的末端分别修饰10～30个地高辛和10～30个生物素；优选地，两个双链DNA手柄的末端分别修饰18个地高辛和18个生物素。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2)中，1μL 50pmol的DNA分子使用10μL浓度为10mg/ml的磁性小球混匀。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤3)中，使样品池的表面耦合抗地高辛包括以下步骤：

在样品池中加入DNA分子与顺磁性小球的组合体之前，向样品池中加入100μL的1mg/ml的抗地高辛溶液，孵育2小时，使抗地高辛耦合在样品池表面。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤3)中，所述解旋酶与DNA分子的摩尔比为0.1～10:1000；更优选地为1:1000。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤4)中，所述待检测的蛋白质与DNA分子的摩尔比为200000:0.1～10；更优选地，所述待检测的蛋白质与DNA分子的摩尔比为200000:1。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤4)中，加入待检测的蛋白质后，孵育5分钟。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤5)中，将结合位置和DNA序列进行对应，得到DNA结合蛋白在DNA上的结合位点和具体的结合序列。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括使用倒置显微镜观测顺磁性小球的位置，以表征DNA分子的长度变化；

优选地，所述方法还包括通过DNA分子长度的变化来测量DNA与蛋白质相互作用中各个结合位点的结合强度的强弱。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括通过发卡DNA分子长度的变化确定发卡DNA与蛋白质结合位点的初始位置和/或末端位置。