[发明专利]检测莴苣花叶病毒的成套试剂

说明书

本发明公开了检测莴苣花叶病毒的成套试剂。本发明公开的检测莴苣花叶病毒的成套试剂由名称为P1的引物对和名称为A1的DNA组成；P1由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；A1为含有所述P1的识别序列的DNA。实验证明，本发明的检测莴苣花叶病毒的成套试剂可在确保目标序列高效扩增的同时有效规避筛查假阴性的发生，且特异性好、灵敏、准确、简便和快速，对进出境相关植物及产品检验检疫具有指导意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的检测莴苣花叶病毒的成套试剂。

背景技术

莴苣(Lactuca sativa L.)是菊科莴苣属植物，是常见的蔬菜之一。高品质的莴苣中含有丰富的无机盐、维生素、烟酸以及微量元素，莴苣中的无机盐有助于调节体内盐的平衡，烟酸可帮助糖尿病人改善糖的代谢功能，维生素和微量元素可维持人正常生命活动，然而莴苣花叶病毒病的发生可严重影响莴苣的品质，导致莴苣的营养价值降低。

莴苣花叶病毒病由莴苣花叶病毒(Lettuce mosic virus，LMV)侵染引起，在自然条件下莴苣感染莴苣花叶病毒后，叶片边缘出现不规则和皱缩症状，继而出现淡绿色或淡黄色斑驳或者花叶症状；病害发生严重时，可导致莴苣严重矮化，结籽率下降，严重影响莴苣产量和质量。LMV是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)重要成员之一，其核酸为正义单链RNA(+ssRNA)，病毒粒体为线状。LMV的自然寄主包括莴苣(Lactucasativa L.)、菠菜(Spinacia oleracea L.)及豌豆(Pisum sativum L.)等多种植物，LMV可通过莴苣种子传递给下一代，并通过蚜虫迅速传播，可导致病害大面积流行。

常用的LMV检测方法主要有生物学测定、血清学测定、病毒粒子特性观察以及分子检测。生物学以及血清学检测方法的检测灵敏度低、耗时长且工作量大；病毒粒子特性观察需使用的电子显微镜，而电子显微镜的高成本及低普及率限制了该技术的发展；目前使用最多的是分子检测技术，主要包括RT-PCR、荧光定量PCR和数字PCR等，这些分子检测技术都需要经过预变性、变性、退火及延伸等步骤，每个步骤都需要热循环仪来保证其对温度的特殊要求且整个过程耗时长。因此解决分子检测技术对温度的限制及耗时长的问题对于病毒检测具有重要意义。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是近年来兴起的一种常温核酸扩增技术。RPA技术模仿体内核酸复制机制，在能结合单链核酸的重组酶uvsX、单链结合蛋白(SSB)Gp32及链置换DNA聚合酶Bsu的作用下进行核酸分子的扩增。重组酶uvsX能在常温下解开双链DNA，反应开始进行时，重组酶uvsX与单链引物DNA结合，形成核酸蛋白复合体，复合体识别与引物序列互补的模板DNA并形成D环状，与此同时，SSB与被置换的单链结合使单链稳定。然后，重组酶uvsX被降解，链置换DNA聚合酶Bsu与核酸蛋白复合体的3′端开始链的延伸，新链与原始链互补配对完成扩增。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测莴苣花叶病毒。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测或辅助检测莴苣花叶病毒的成套试剂，所述成套试剂由名称为P1的引物对和名称为A1的DNA组成；

所述P1由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；

所述A1为含有所述P1的识别序列的DNA。

所述A1可为a1)或a2)：

a1)含有序列表中序列3所示DNA片段的DNA；

a2)序列表中序列3所示的DNA片段。