[发明专利]一种表达重组GnRH与GRP融合蛋白的基因工程菌的构建

说明书

本发明属于基因工程领域，本发明公开提供了关于一种重组GnRH与GRP的大肠杆菌菌株及制备方法。本发明提供的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pET28a‑G₃G₆，CCTCC NO：M 2018039。该工程菌含有重组质粒pET28a‑GnRH₃‑hinge‑MVP‑NRLLLTG‑SSG‑GRP₆，质粒上有重组突变GnRH₃‑hinge‑MVP‑NRLLLTG‑SSG‑GRP₆基因，该基因具有SEQ ID NO.1所示的基因序列。BL21(DE3)/G₃G₆菌株经乳糖诱导，可高效表达重组蛋白GnRH₃‑hinge‑MVP‑NRLLLTG‑SSG‑GRP₆，该蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。该重组蛋白预期可以提高机体对肿瘤细胞的免疫应答，打破免疫耐受，达到识别和杀灭肿瘤细胞的目的，对于抗肿瘤治疗具有很好的临床应用前景。

技术领域

在基因工程和蛋白质工程领域，本发明公开了一种表达新型重组融合蛋白工程菌及其构建方法，以及该融合蛋白的纯化。

背景技术

基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。可大致分为上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建(即DNA重组技术)；下游技术：基因工程菌(细胞)的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化过程。

肿瘤抗原(tumor antigen)泛指在肿瘤发生、发展过程中新出现或过度表达的抗原物质。普遍可分为肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原。肿瘤特异性抗原(tumor-specificantigen，TSA)是肿瘤细胞特有的或只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞的新抗原。肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)是指非肿瘤细胞所特有的、正常细胞和其他组织上也存在的抗原，只是其含量在细胞癌变时明显增高。针对这些抗原发展起来的肿瘤特异性免疫治疗，是肿瘤生物治疗的重要方法。

肿瘤疫苗(tumor vaccine)是将肿瘤抗原以多种形式导入患者体内，克服肿瘤引起的免疫抑制状态，增强免疫原性，激活患者自身的免疫系统，诱导机体细胞免疫和体液免疫应答，从而达到控制或清除肿瘤的目的。

肿瘤疫苗按抗原成分的类型可分为肿瘤细胞型疫苗、肿瘤抗原多肽及蛋白疫苗、DNA疫苗和树突状细胞疫苗等。无论何种类型的肿瘤疫苗，其研制的关键都在于选择合适的针对肿瘤的靶抗原和提高免疫原性。

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone，GnRH)主要由下丘脑下部弓状核的GnRH神经元合成并分泌，它可贮存于一种称为伸展细胞的特殊的脑室细胞中，受到性刺激或高级中枢神经递质的刺激时，由丘脑下部以脉冲的方式分泌进入垂体门脉系统到垂体前叶，与垂体细胞膜上高亲和力的GnRH受体(GnRH-receptor，GnRH-R)特异地结合，促进垂体前叶黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的合成和分泌，进而通过血液循环，调节外周靶性腺类固醇激素的产生。

传统的神经内分泌理论认为，垂体促性腺细胞是GnRH的唯一靶器官。最近的研究显示，GnRH在下丘脑和垂体外的其他器官中也有作用。在子宫、卵巢、输卵管、胎盘、乳腺、前列腺、外周血单核细胞、结肠、直肠和肾的肿瘤细胞以及淋巴瘤和黑素瘤中都发现了GnRH受体，且相比与正常的下丘脑、垂体等组织，肿瘤细胞表面呈高表达。这提示我们GnRH及其受体是肿瘤治疗的理想靶点。