[发明专利]一种表达重组GnRH与GRP融合蛋白的基因工程菌的构建

权利要求书

1.一种表达生产重组蛋白GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6的大肠杆菌菌株，其特征在于大肠杆菌菌株Escherichia coli BL21/pET28a-G₃G₆：pET28a-GnRH₃-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP₆，保藏编号：CCTCC NO：M 2018039。

2.根据权利要求书1所述的该大肠杆菌菌株BL21/pET28a-G₃G₆，其特征在于：大肠杆菌细胞中含有重组质粒pET28a-G₃G₆：pET28a-GnRH₃-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP₆。

3.根据权利要求书2所述的该大肠杆菌菌株BL21/pET28a-G₃G₆中重组质粒pET28a-GnRH₃-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP₆，其特征在于：含有重组的GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6，可表达融合蛋白，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

4.一种制备权利要求书1所述的该大肠杆菌菌株的方法，它包括以下步骤：

(I)用质粒提取试剂盒提取质粒pET28a-mGM-CSF-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG和pET28a-mGM-CSF-GRP6，通过PCR方法扩增出目的片段GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG。

(II)用限制性内切酶Nco I、Nhe I切割GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG和pET28a-mGM-CSF-GRP6质粒，用E.coli DNA连接酶4℃连接过夜，将其转化大肠杆菌菌株，获得含质粒pET28a-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6的菌株。

(III)鉴定重组质粒：使用菌落PCR法、单酶切、双酶切方法进行验证，将重组菌株进行测序验证。

5.根据权利要求3所述的一种新型融合蛋白GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6，其特征在于：该基因表达的融合蛋白实际分子量约为14.9kDa，其N端为3段串联重复的GnRH序列及IgG的铰链区及麻疹病毒融合蛋白序列中的288-302氨基酸片段MVP，C端为GRP十肽的6段串联重复，N端和C端之间利用SSG柔性肽连接。

6.根据权利要求5所述的GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6蛋白的重组方法，其特征在于：包含抗肿瘤疫苗的抗原表位GnRH、GRP，具有更强的抗肿瘤功能。

7.一种GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6重组蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含步骤：

(I)根据权利要求4所述步骤构建宿主菌

(II)通过乳糖诱导，超声破碎，包涵体洗涤，包涵体裂解，透析复性来初步获得重组蛋白

(III)通过Sephadex G-50分离出GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG-SSG-GRP6，该融合蛋白纯度可达SDS-PAGE电泳纯。