[发明专利]LsH3在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜分析中作为内参基因的用途

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及LsH3基因在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qRT‑PCR分析中作为内参基因的用途。本发明利用瓠瓜转录组数据，在全基因组水平上比较了基因的表达水平和稳定性，并通过使用LsIPT或LsDdRP基因进行验证，确定所揭示的LsH3基因在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片和果实中均能稳定表达，是瓠瓜在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下利用qRT‑PCR技术检测基因表达分析的可靠内参基因。本发明首次将LsH3基因作为内参基因用于瓠瓜基因表达分析，解决了现有瓠瓜定量PCR检测中没有内参基因的现状。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基因在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qRT-PCR分析中作为内参基因的用途。

背景技术

瓠瓜(Lagenaria siceraria var.hispida)，为葫芦科葫芦属一年生蔓性草本，是可消肿结、润肌肤的药用瓜菜。中国自古就有栽培，嫩果是民间夏令常吃的佳肴，口感细嫩柔软，稍有甜味，去皮后全可食用。成熟老果不可食用，中国古时以其老熟干燥果壳作容器，也作药用。瓠瓜在我国南北各地均有栽培，南方栽培普遍，近几年北方也开始引种栽培。

近年来，随着西瓜上黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaicvirus,CGMMV)的发生危害频频报道，作为西瓜砧木的瓠瓜携带CGMMV的病例也有大量报道。CGMMV侵染西瓜导致新叶产生淡绿色或淡黄色的花斑，而后形成绿色的突起，甚至使叶片产生畸形。随着病叶老化，症状逐渐减弱，与正常植株相比，病株生长缓慢，植株矮小，有时还出现萎蔫症状。有时感病西瓜果实的表面出现镶嵌斑驳或是颜色浓绿的圆斑，其中央还会可能产生坏死点。有时感病西瓜果实表面没有症状，但果实内部，靠近种子的果肉呈褐紫色的浑浊而不透明的水浸状，果肉出现纤维化，甚至出现空洞、腐烂。而CGMMV侵染的瓠瓜叶片表现为黄化、花叶或是脉间黄化沿叶脉呈绿带状，有时伴随绿色突起。一般病株顶部叶片表现为黄化、花叶、绿色突起、变小，底部叶片沿叶脉皱缩，叶边缘呈现波浪状，叶片畸形，有时老叶也会出现隐症。幼果感病后，果实表面表现斑驳或是绿色部分突起等症状，待果实成熟后症状消失，病果果梗出现褐色坏死。CGMMV侵染不同寄主叶片表现症状类似，但在果实上则差异较大的现象引起了人们的关注。

目前对葫芦科作物的功能基因研究仍比较落后，在瓠瓜功能基因研究中利用qRT-PCR分析基因表达的研究尚未见报道，仅在甜瓜和西瓜等近源物种中针对生物或非生物胁迫、果实发育等阶段有少量应用传统内参基因的相关报道。因此目前对CGMMV侵染后瓠瓜叶片和果实基因进行表达分析时，只能参考其他物种选用表达稳定性缺乏系统验证的传统内参基因，这严重影响了瓠瓜在被病毒侵染后叶片和果实中基因表达分析的准确性。而近年来兴起的转录组测序技术，为我们筛选CGMMV侵染后瓠瓜叶片中稳定表达的内参基因提供了可能。

这就需要提供葫芦科植物在作为黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下的专属内参基因，为准确监测、预防该病提供可能。

发明内容

本申请以CGMMV侵染前后的瓠瓜为试验材料，检测候选持家基因和葫芦科传统内参基因在瓠瓜叶片和果实中基因表达情况，揭示候选基因在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qRT-PCR分析中作为内参基因的用途。

为解决瓠瓜在被黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染后叶片或果实中进行基因表达定量分析时缺乏经系统验证、表达稳定的内参基因的问题。本发明的目的之一在于提供一种LsH3基因在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qRT-PCR分析中作为内参基因的用途。

在一些优选的方式中，所述的LsH3基因序列如SEQ ID No.1所示。

在一些优选的方式中，所述的内参基因的引物为：正向引物序列：CAAACTGCCCGTAAGTCCAC；反向引物序列：GGCTTCTTCACTCCTCCTGT。