[发明专利]LsH3在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜分析中作为内参基因的用途

权利要求书

1.LsH3在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qRT-PCR分析中作为内参基因的用途，其特征在于：所述的内参基因LsH3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qRT-PCR分析LsIPT或LsDdRP的方法，其特征在于，它包括如下步骤：

步骤1：供试样品处理

瓠瓜幼苗种植于温室土壤中，保持温度20-25℃，每3天浇一次水，在两叶一心期将黄瓜绿斑驳花叶病毒病汁液摩擦接种于展开的系统叶片；病汁液是通过将100mg黄瓜绿斑驳花叶病毒感病组织匀浆于20倍体积的PBS缓冲液中所形成；健康植株用PBS缓冲液处理作为对照；

随机选取黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染的瓠瓜系统叶片、果实和健康瓠瓜系统叶片、果实于液氮中保存备用；

步骤2：RNA的提取和cDNA的合成

将液氮中保存备用的供试样品进行RNA提取，每个处理设置3次生物学重复；用变性凝胶电泳和生物分析仪检测RNA质量和浓度；对上述每个RNA进行反转录得到对应的cDNA；

步骤3：提供参考基因LsIPT或LsDdRP的引物，其中，

LsIPT引物的核苷酸序列如下：

正向引物序列：GCACTCCAATGGCTCGTTTA；

反向引物序列：GGTCGATGGTGGATTTGTCG；

LsDdRP引物的核苷酸序列如下：

正向引物序列：AAACTCCCTTTCAGCCTCGA，

反向引物序列：AGATGTGGCCCTGTTGAGAA；

提供内参基因LsH3的引物，所述LsH3引物的核苷酸序列如下：

正向引物序列：CAAACTGCCCGTAAGTCCAC；

反向引物序列：GGCTTCTTCACTCCTCCTGT；

步骤4：qRT-PCT分析

将已合成的cDNA溶液稀释5倍作为qRT-PCR的初始浓度；10μL qRT-PCR反应体系包含：5μL的2×SYBR Premix Ex Taq溶液，0.5μL的cDNA溶液，参考基因LsIPT或LsDdRP以及内参基因LsH3的正向、反向引物各0.15μL，3.9μL的RNase Free dH₂O；

反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸15sec，40个循环；每个样品设置3次重复。