[发明专利]牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗原多表位融合肽及其制备与应用

说明书

本发明公开了BVDV E2多表位融合肽及其制备方法，即基因合成优选出的BVDV‑1和BVDV‑2的E2蛋白的各2个抗原表位串联序列，并将序列克隆到pET‑28a(+)载体，转化大肠杆菌DH‑5α，将正确的重组载体转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达，Ni‑NTA纯化，即得BVDV E2多表位融合肽。动物免疫E2抗原多表位融合肽后，能产生BVDV的中和抗体，可用于BVDV表位疫苗的研发；利用E2抗原多表位融合肽制备的ELISA检测试剂盒可用于牛群的BVDV抗体检测，具有特异性强、敏感性高、重复性好、易于操作的优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及BVDV E2蛋白抗原多表位融合肽及其制备与应用，具体涉及BVDV-1型和BVDV-2型E2蛋白的抗原多表位融合肽及其制备方法，以及该BVDV-1型和BVDV-2型E2蛋白的抗原多表位融合肽在BVDV表位疫苗和诊断试剂中的应用。

背景技术

牛病毒性腹泻-黏膜病是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的一种重要传染病，临床上以发热、腹泻、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、持续感染、免疫抑制、怀孕母牛流产、产死胎和畸型胎或致死性粘膜病为主要特征。该病呈世界性分布，给全球养牛业发展造成了巨大的经济损失。我国目前已有20多个省市自治区分离到BVDV或检测到了该病毒的抗体。中华人民共和国农业部发布第96号公告，将牛病毒性腹泻定为三类疫病，世界动物卫生组织(OIE)也将该病列为法定报告的动物疫病及国际动物胚胎交流病原名录三类疫病。目前养牛业发达国家主要采取疫苗免疫并净化持续感染牛为主的综合防制措施，我国仅有灭活疫苗，尚未大范围的推广应用，该病在我国牛群中的流行呈上升趋势，给养殖业造成严重的经济损失。

根据BVDV基因组5’-UTR序列差异，将BVDV分为BVDV-1和BVDV-2，其中每种基因型都含有多种毒株，每种毒株的致病差异很大。BVDV基因组只含有一个大的编码区，至少生成11种成熟的蛋白，它们在基因组上的位置从N端到C端依次为5′-P20(N^pro)-P14(C)-gp48(E^rns)-gp25(E1)-gp53(E2)-P7-P125(NS2-3)-P10(NS4A)-P30(NS4B)-P58(NS5A)-P75(NS5B)-3′。其中，C、E^rns、E1、E2为病毒的结构蛋白，E2蛋白是主要的保护性抗原，在宿主细胞受体识别、吸附、介导免疫中和反应等方面发挥重要的功能，由于E2糖蛋白变异最大，这也是导致疫苗免疫失败和病毒持续性感染的主要原因。

目前BVDV在防制上，还是个很棘手的问题，目前暂无有效药物和预防措施，在国外，主要使用接种BVDV疫苗，检测并淘汰持续期感染的牛只和处于免疫免疫耐受的动物，并辅助消毒净化等预防措施。到目前为止，全世界所研制并投入生产的疫苗为灭活苗和弱毒苗，灭活苗的安全系数高，但免疫期短；弱毒苗安全性低，免疫期长。国内暂无安全有效的BVDV疫苗，虽然有关于疫苗的不少研究，但是都未正式投入生产。BVDV国际标准检测试剂盒基本上被国外公司垄断，价格昂贵，购买周期太长，不适用于中小型养殖场和散养户。