[发明专利]牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗原多表位融合肽及其制备与应用

权利要求书

1.一种BVDV E2抗原多表位融合肽，其特征在于，N端到C端具有序列表中SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的BVDV E2抗原多表位融合肽，其特征在于，是由4种抗原表位氨基酸序列构成：序列表中SEQ ID No.2所示的BVDV1-E2 中69-79位点的序列、序列表中SEQID No.3所示的BVDV1-E2 中304-318位点的序列、序列表中SEQ ID No.4所示的BVDV2-E2中67-77 位点的序列和序列表中SEQ ID No.5所示BVDV2-E2中302-316位点序列；

所述4种抗原表位通过柔性链串联连接组成。

3.编码权利要求1~2任一所述BVDV E2抗原多表位融合肽的基因。

4.根据权利要求3所述基因，其特征在于，是具有下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID NO.6所示的DNA序列；

2）与SEQ ID NO.6具有至少90%的同源性，且能够表达序列表中SEQ ID NO.1蛋白质序列的DNA序列。

5.含权利要求3或4任一所述基因的重组表达载体、宿主细胞和重组阳性菌；所述重组表达载体是基因插入到大肠杆菌表达载体pET28a(+)中得到的表达BVDV-1型和BVDV-2型E2蛋白的抗原多表位融合肽的重组表达载体；所述重组阳性菌是将含基因的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到重组阳性菌。

6.权利要求1-2任一项所述的BVDV E2抗原多表位融合肽在制备BVDV表位疫苗中的应用。

7.一种BVDV E2抗原多表位融合肽间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-2任一项所述的BVDV E2抗原多表位融合肽预包被酶标板。

8.权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述BVDV E2抗原多表位融合肽的包被方法为：将纯化的BVDV E2多表位融合肽用包被缓冲液稀释至4μg/mL，包被酶标板，每孔加100μL，4℃过夜，用洗涤液洗涤3次，每次2min；然后加入10%马血清200μL/孔，37℃孵育2h，随后用洗涤缓冲液洗涤3次，每次2min，真空包装后置于4℃保存备用。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含血清稀释液、酶标记结合物稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标记结合物、洗涤液、底物显色液和终止液；

所述血清稀释液为含BSA和0.5‰Tween-20的磷酸盐缓冲液，血清稀释度为1:80，血清反应条件为37℃ 60 min；

所述阴性对照液为BVDV进口试剂盒检测的阴性牛血清，所述阳性对照液为BVDV感染后的阳性牛血清；

所述酶标记结合物为辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG，所述酶标记结合物稀释度为1:5000，反应条件为37℃下反应1h；

所述洗涤液为0.5‰ Tween-20的磷酸盐缓冲液；

所述底物显色液反应条件为37℃下反应10min；

所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述底物显色液的配方为：每500mL加EDTA-2Na 0.2g、柠檬酸0.95g、甘油50mL和TMB粉末0.15g。

11.权利要求7-10任一项所述试剂盒在检测BVDV 血清抗体中的应用，所述应用为非疾病诊断领域。