[发明专利]基于核酸适配体-量子点结合苏云金芽孢杆菌孢子的荧光测定法

说明书

本发明公开了一种基于核酸适配体‑量子点结合苏云金芽孢杆菌孢子的荧光测定法，包括Cry1Ab蛋白即Bt蛋白的、核酸适配体‑量子点混合物的制备，将核酸适配体‑量子点与芽孢杆菌孢子结合。本发明通过核酸适配体‑量子点与芽孢杆菌孢子结合的方法对转基因水稻中Bt蛋白结果进行检测，检测结果客观、易判定，可对转基因产品的含量进行定量分析，同时检测速度快，检测灵敏度高。

技术领域

本发明属于转基因成分的检测技术领域，具体涉及一种基于核酸适配体-量子点结合苏云金芽孢杆菌孢子的荧光测定法。

背景技术

转基因生物的安全评价是转基因生物及其产品市场化和商品化的前提，在安全评价中转基因成分的检测是一项重要内容。

我国对转基因水稻的研究处于世界领先水平，其中，研发的一些抗病、抗虫转基因水稻品系已经申请生产种植用生物安全证书，但由于它们的转基因生物安全问题等一些原因，至今尚未有品系批准商业化生产应用。鉴于转基因水稻技术的成熟以及其产品市场化的趋势，因此建立一种快速、简便的检测Bt蛋白的方法，具有必要性和紧迫性。

目前对于转基因成分的检测可从外源基因的核酸和蛋白质两个水平进行。核酸水平的检测，主要针对转入的外源基因的核苷酸序列并根据外源基因与内源基因的同源性设计检测方法，主要采用的方法是PCR扩增，即依据转入外源基因的启动子、目的基因、终止子及表达(重组)载体信息，设计特异性引物，进行聚合酶链式反应，依据产物的有无或多少判断是否为转基因产品。PCR反应具有高灵敏度、高特异性、高效性的特点，是转基因产品初筛阶段的主要检测方法。

蛋白检水平的检测，主要是基于抗原和抗体相互作用的免疫学方法，针对转基因植物及其产品中外源目的基因表达的特异性蛋白进行定性和定量检测。1971年瑞典的Engvall等人分别以纤维素和聚丙乙烯试管作为固相载体吸附抗原/抗体，建立了酶联免疫吸附法(Enzyme Linked ImmunosrbentAssay，简称ELISA方法)。1974年Voller等人改用聚苯乙烯微量反应板作为固相免疫吸附载体，使ELISA方法得以推广应用，使得用于抗原定位的酶标记抗体技术发展成为液体标本中微量物质的测定方法，并逐渐成为抗原抗体检测中最为常用的一种方法。它将酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大的提高了灵敏度。同时它又是一种非均相免疫分析方法，即在反应的每一步都有洗涤过程，从而除去了未反应物和干扰物质。由于ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测迅速和非放射性以及可以批量测定等诸多优点，使得ELISA方法得到了越来越广泛的应用。

但是随着检测灵敏度的要求越来越高，通过转基因成分的检测和蛋白质两个水平的检测已经完全不能满足目前发展的需要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种适用于转基因水稻中Bt的高灵敏度快速检测方法，利用核酸适配体-量子点结合苏云金芽孢杆菌孢子实现快速的检测。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于核酸适配体-量子点结合苏云金芽孢杆菌孢子的荧光测定法，包括以下步骤：

(1)核酸适配体-量子点的制备：

1.1、将13.9μL 10mM SMCC(琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯)添加到125μL量子点中并在室温下放置一小时以激活量子点；

1.2、在300μL 1mg/ml一倍工作浓度的PBS溶液中制备5′巯基修饰的寡核苷酸，向溶液中加入6.1μl 1m的二硫苏糖醇(DTT)并在室温下放置30分钟以缩减适配体；

1.3、激活量子点的溶液以及缩减适配体的溶液分别通过一个nap-5脱盐柱(Sephadex G-25脱盐柱)，每个溶液收集500μl；