[发明专利]基于核酸适配体-量子点结合苏云金芽孢杆菌孢子的荧光测定法

权利要求书

1.一种基于核酸适配体-量子点结合苏云金芽孢杆菌孢子的荧光测定法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)核酸适配体-量子点的制备：

1.1、将13.9μL 10mM SMCC(琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯)添加到125μL量子点中并在室温下放置一小时以激活量子点；

1.2、在300μL 1mg/ml一倍工作浓度的PBS溶液中制备5′巯基修饰的寡核苷酸，向溶液中加入6.1μl 1m的二硫苏糖醇(DTT)并在室温下放置30分钟以缩减适配体；

1.3、激活量子点的溶液以及缩减适配体的溶液分别通过一个nap-5脱盐柱(SephadexG-25脱盐柱)，每个溶液收集500μl；

1.4、然后将量子点和缩减适体在室温下反应一个小时。将10.1μLβ-巯基乙醇(100μM的最终浓度)加入到混合物中来淬火共轭反应，并在室温下放置30分钟，通过柱纯化，共收集到250μL核酸适配体-量子点；

1.5、将10μl核酸适配体-量子点溶解在1ml反渗透纯净水中。运用一个uv-2100分光光度计来衡量在260nm时的吸光度；

1.6、核酸适配体-量子点的实际浓度由与最初的核酸适配体浓度(1.08mg/ml)进行比较来决定；

(2)将核酸适配体-量子点与芽孢杆菌孢子结合：

2.1、将30μL核酸适配体-量子点放置在一个试管中并用600μL PBS进行稀释；

2.2、用同样的程序进行一系列重复的反应：核酸适配体-量子点无孢子，非结合的量子点与Bt孢子，核酸适配体-量子点与纯化的Bt孢子结合，核酸适配体-量子点与BG孢子结合；

2.3、之前收集的孢子，用PBS将13mm微孔膜过滤器(PVDF，亲水性，0.45μm)洗两次，孢子暴露于核酸适配体-量子点或非结合的量子点中的任何一个后在过滤器中收集并用1ml一倍工作浓度的PBS溶液洗涤三次，洗过的孢子在1ml PBS中收集。

2.根据权利要求1所述的基于核酸适配体-量子点结合苏云金芽孢杆菌孢子的荧光测定法，其特征在于：在所述步骤1.4中，反应产物使用0.5ml集中器集中，然后添加到200柱Superdex脱盐柱并用PBS进行洗脱。

3.根据权利要求1所述的基于核酸适配体-量子点结合苏云金芽孢杆菌孢子的荧光测定法，其特征在于：所述步骤1.6中，核酸适配体共轭量子点的百分比被确定为98％。

4.根据权利要求1所述的超声波乳化装置，其特征在于：在所述步骤(2.2)中，将PBS稀释的100μL核酸适配体-量子点分别加入900μL 107,106,105,104,103CFU的Bt孢子中。混合物用VSM 3旋涡混合器短暂的涡旋(速度8)并放置在室温下反应20min。