[发明专利]一种快速提取棉花纤维DNA的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种快速提取棉花纤维DNA的方法及其应用，本发明选用棉花纤维作为DNA提取材料，经打碎后在裂解液中裂解，经过多次离心、沉淀，提取得到棉花纤维DNA。该方法操作简单，可快速进行批量DNA提取，耗时少，并以所获得的纤维DNA作为模板，对特定基因进行了常规PCR扩增，结果表明所提取的纤维DNA可满足于常规PCR和SSR分子标记PCR扩增。基于上述特性，通过提取成熟棉纤维DNA，可为棉花重要农艺性状基因的分子标记辅助选择育种提供可行的方法，同时在棉花品种溯源方面研究也具有较好的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速提取棉花纤维DNA的方法及其应用。

背景技术

棉花作为重要的经济作物，棉纤维与人们的生活息息相关。棉纺织品一直以来被列为中国进口商品中的重要项目，目前我国每年进口棉花高达上百万吨，来自世界40多个国家和地区，总货值达上百亿美元。大量进口的棉花虽然缓解了国内供需矛盾，但对国产棉原有市场份额造成冲击，同时进口棉花出现了以次充好、弄虚作假等一系列质量不合格等问题，因此迫切需要一种简便方法来进行棉花品种纯度检测以及产地溯源。目前有多种方法来鉴定棉花品种纯度和真实性，如：小区种植鉴定法、卡那霉素法和DNA分子标记法(周大云等)。DNA分子标记法具有检测速度快、成本低、结果可靠等特点备受人们青睐。

简单序列重复SSR(Simple Sequence Repeats)又称微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)标记，实验操作中对DNA的数量和质量要求不高，即使部分样品有所降解也可进行分析；实验程序简单，操作简便、快速，用时短，不需要使用同位素；扩增产物可靠稳定，重复性好；被认为是目前构建指纹图谱的首选标记，目前已有多种植物以SSR分子标记方法构建了相应的指纹图谱，为品种纯度和真伪性鉴定提供理论依据，也为分子育种过程中亲本的选育提供参考。

常规用于棉花分子标记的组织多为种子、叶、茎等组织，很少采用棉花纤维作为供试材料，由于成熟棉纤维含有超过90％的纤维素，且DNA多发生降解，这些都限制着提取的棉纤维DNA的数量和品质。因此开发一种快速提取棉花纤维DNA的方法，且提取的DNA能满足于常规PCR和SSR-PCR扩增，对研究棉花重要农艺性状和棉花品种纯度以及产地溯源具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速提取棉花纤维DNA的方法及其在常规PCR扩增和SSR-PCR扩增中的应用，旨在开发以棉花纤维为介质来进行品种纯度鉴定、产地溯源等方面的应用。

本发明具体通过以下技术方案来实现：

一种快速提取棉花纤维DNA的方法，包括以下步骤：

1)将棉花纤维充分剪碎后用液氮研磨；

2)加入细胞裂解液充分混合，水浴30分钟；

3)加入等体积抽提液离心后，取上清加入-20℃预冷异丙醇，缓慢颠倒离心管直至有沉淀析出，-20℃静置20分钟；

4)离心弃掉上清液；

5)加入70％乙醇水溶液，离心弃掉上清液，重复2～3次；

6)加入无水乙醇离心，弃掉废液，室温晾置；

7)加入无菌水，4℃保存。

进一步，步骤(2)中所述的细胞裂解液为：Tris 100mmol/L、EDTA 10mmol/L、CTAB20g/L、PVP-30 20g/L、Tween20 20g/L、NaCl 1mol/L、β-巯基乙醇2％(v/v)，调pH至8.0。

进一步，步骤(2)中水浴温度保持在65℃。

进一步，步骤(3)所述的抽提液为氯仿和异戊醇按照体积比为24:1配置得到。