[发明专利]一种硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺及其制备方法

说明书

本发明属于生物医药技术领域，具体公开了一种肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺及其制备方法，包含如下步骤：(1)酶法降解肝素得到肝素二糖；(2)利用RAFT反应制备分子量可控且单分散的聚甲基丙新酰乙醇胺；(3)肝素二糖室温条件下通过连接剂接枝聚甲基丙新酰乙醇胺；(4)肝素二糖接枝聚甲基丙新酰乙醇胺的硫酸化。本发明的合成方法利用肝素二糖接枝在合成高分子骨架上，同时硫酸化，保证负电荷密度，检测表现出低抗凝血活性以及抗肿瘤转移特异性性能；其反应条件温和、易控，原料易得、成本较低，将有助于肝素类抗肿瘤药物的开发。

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺及其制备方法。

背景技术

肝素，常常存在于肥大细胞中，也存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，由于其各种亲和力在临床中被广泛用作抗凝药物。肝素最为人所熟知的是它在血液凝固过程中的作用，但在是生物活性功能中也能发挥其他作用比如抗炎、抗血管生成、及抗肿瘤作用。其中，肝素的抗肿瘤作用已经备受关注，许多研究已经证明了肝素能够抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。然而天然肝素是在结构上不均一的混合物，导致生物活性标准难以界定，构效关系和作用机理的研究非常困难。而天然肝素的强抗凝血活性可能会引发出血和血小板减少症等毒副作用。这限制了天然肝素的应用。此外，天然肝素的唯一来源是动物组织，具有可能带来病毒污染和不良反应的风险。而肝素在治疗中还可能会被肝素酶和其他酶在体内分解，导致失去生物活性。

肝素的抗凝血活性主要来自其包含的特定戊糖序列，该序列结构能够与抗凝血酶(AT-Ⅲ)结合，活化抗凝血酶，由于肝素具有的抗凝血活性，所以大量使用肝素会引起出血和诱导血小板减少等作用；此外，研究人员发现，肝素的抗肿瘤活性与其抗凝血能力并没有直接关联，而是由于肝素糖环伴随的氢键形成，和肝素硫酸根负电荷的作用，使肝素能够结合肿瘤转移过程中起重要作用的蛋白质的结果。因此，低抗凝血肝素的开发引起了很大关注，尤其在抑制肿瘤生长和转移方面。

申请号CN2012103286497的中国专利申请公开了一种控制生产低分子量肝素的方法，利用肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中两种以上的肝素酶来降解肝素从而生产低分子量或超低分子量肝素，然而，由于肝素及其低分子量肝素结构的特异性和多分散性，导致副作用的风险高。

最近几年，许多研究者还尝试使用化学法合成结构明确的肝素二糖和肝素衍生物以减弱抗凝血活性，然而,这种方法伴随着生产的高成本和合成的困难，硫酸化程度的降低也减弱了肝素的抗肿瘤活性。因此去除具有抗凝能力的五糖序列，将确定组分的肝素二糖接枝在丙烯酸酯长链上并加以硫酸化，就有可能降低结构异质性，消除抗凝血活性，并提高其抗肿瘤活性，合成刷状具有抗肿瘤作用的肝素类似物大分子。

发明内容

针对现有问题的不足，本发明的目的是提供一种硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺及其制备方法；制备方法较为简单，具有原料低廉、反应条件温和易控等优点。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

一种硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺，通过联用过量肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ，将天然肝素完全降解，分离制备得到天然二糖，将二糖接枝在特定分子量的丙烯酸酯长链上，加以硫酸化，得到具有良好化学稳定性，低抗凝血，优异生物相容性、抗肿瘤性能的类肝素大分子。

上述硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺的制备方法，包括如下步骤：

(1)肝素二糖的制备与分离：首先加入过量肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ将天然肝素完全酶解；然后利用G25、强阴离子色谱交换柱、G10凝胶脱盐得肝素二糖；

(2)聚甲基丙烯乙醇胺(PAMA)的合成：以乙醇胺盐酸盐、甲基丙烯酰氯为原料，合成甲基丙烯乙醇胺单体，再利用RAFT反应制备特定分子量的聚甲基丙烯乙醇胺；特定分子量的聚甲基丙烯乙醇胺通过RAFT反应实现，反应中通过控制添加引发剂、链转移剂添加量，同时控制反应条件实现分子量可控；