[发明专利]高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用。所述工程菌为大肠杆菌或地芽孢杆菌，并携带有表达地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体。利用高温产核黄素的大肠杆菌工程菌生产核黄素，发酵液中核黄素产量最高可达276mg/L左右，利用高温产核黄素的地芽孢杆菌工程菌生产核黄素，产量最高可达50mg/L左右。本发明提供的工程菌比现有的核黄素工程菌生产周期短，节约能源，可以低成本地用于核黄素的生产，为高温条件下生产核黄素提供宝贵的菌种资源。

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵工程技术领域，具体地说，涉及高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

核黄素，即维生素B2(Riboflavin)，是细菌和动物必需的维生素之一，在生物体内通常以FMN和FAD的形式存在，参与细胞内氧化还原反应。它主要应用在制药，饲料添加剂，食品添加剂和化妆品，目前，核黄素生产工艺是微生物发酵法。在早期其生产菌株为真菌，像解朊假丝酵母(Candida famata)、棉囊阿舒氏酵母(Ashbya gossypii)、阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)等(Stahmann et al,2016,Appl Microbiol Biotechnol 100:2107-2119)。但由于真菌生产核黄素存在着一些问题，例如发酵周期长(6-7天)、产量较低(小于5g/L)、原料成分配比复杂、菌体粘度大、后期分离困难、需加入不饱和脂肪酸来促进核黄素合成等。随后，又开发了以细菌为宿主菌的基因工程菌。这些基因工程菌具有发酵周期短(2-3天)、原料要求简单、产量高、成熟的原核细胞基因工程技术等优点，迅速替代了利用真菌的生产技术。目前，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)通过遗传改造成为主要的核黄素工业生产菌，但其生产过程属于常温发酵，能耗高。主要体现在生产过程中需维持常温，以缓解发酵过程的生物热。与之相比，高温发酵(45～60℃)更具有优势。对于细菌个体，在较高温度下，细胞内酶的反应速率提高，细胞生长快。对于工业生产，高温发酵缩短了发酵周期，一是细菌生长快，可在较短时间内达到产目的代谢物的生产状态；二是设备原料等高温灭菌冷却时间较少，节能节水。同时，高温发酵节约生产成本，在生产过程的冷却水维持恒定温度是必不可少的，且常温发酵过程中冷却水的耗费约占生产成本的20％，而高温发酵可以减少甚至不使用冷却水。此外，高温发酵可以避免常温杂菌的污染，减少原料的浪费。因此，开发核黄素高温生产工艺是未来核黄素工业发展的方向。

发明内容

本发明的目的是提供高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用，特别是高温产核黄素的地芽孢杆菌和大肠杆菌工程菌的构建及应用。

为了实现本发明目的，本发明提供的高温产核黄素的工程菌，其为大肠杆菌或地芽孢杆菌，并携带有表达地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体。

优选地，所述大肠杆菌的出发菌株为JM109、EK-12MG1655或BL21(优选JM109)，所述地芽孢杆菌的出发菌株为热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)NCIMB 11955。

优选地，所述地芽孢杆菌核黄素合成基因簇来自于热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)NCIMB 11955或热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)CGMCC 1.5331，用于扩增热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌核黄素合成基因簇tgrib的引物序列如SEQ ID NO:1-2所示，用于扩增热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇dnrib的引物序列如SEQ ID NO:3-4所示。