[发明专利]高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.高温产核黄素的工程菌，其特征在于，其为大肠杆菌或地芽孢杆菌，并携带有表达地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体；

所述大肠杆菌的出发菌株为JM109，所述地芽孢杆菌的出发菌株为热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)NCIMB 11955；

所述地芽孢杆菌核黄素合成基因簇来自于热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)NCIMB 11955或热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)CGMCC 1.5331，用于扩增热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌核黄素合成基因簇tgrib的引物序列如SEQ ID NO:1-2所示，用于扩增热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇dnrib的引物序列如SEQ ID NO:3-4所示；

所述表达载体为pUCG3.8或其他大肠杆菌地芽孢杆菌穿梭载体。

2.权利要求1所述工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以质粒pTAC-RiboJ-gfp为模板，用引物sgfps和sgfpa进行PCR扩增，获得sgfp和终止子T3序列；以热脱氮地芽孢杆菌基因组为模板，用引物Pldhs和Pldha进行PCR扩增，获得启动子pLdh序列；然后经过融合PCR，得到pLdh-sgfp-T3序列；将pUCG3.8和pLdh-sgfp-T3进行EcoRI和BamHI双酶切，然后T4连接酶连接，经转化，卡那霉素抗性筛选，获得重组质粒pUCG3.8S；

(2)以pUCG3.8S为模板，用引物pucG3.8ls和pucG3.8la进行PCR扩增，获得含有pLdh和T3终止子的载体骨架序列；

(3)以热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)NCIMB 11955基因组为模板，用引物Tgribs和Tgriba扩增得到核黄素合成基因簇tgrib；再以热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)CGMCC 1.5331基因组为模板，用引物Dnribs和Dnriba扩增得到核黄素合成基因簇dnrib；

(4)将上述步骤(2)含有pLdh和T3终止子的载体骨架序列分别与步骤(3)的核黄素合成基因簇tgrib和dnrib进行Gibson组装，转化JM109，筛选得到重组质粒pUCG3.8-R1和pUCG3.8-R2；

(5)将上述重组质粒pUCG3.8-R1或pUCG3.8-R2转入大肠杆菌或地芽孢杆菌，从而获得高温产核黄素的工程菌；

所用引物序列见表1：

表1

3.权利要求1所述工程菌在发酵生产核黄素中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌，将菌种接入含有抗生素的LBG培养基中，在≤45℃条件下发酵生产核黄素；

其中，所述LBG培养基为含有10g/L葡萄糖和20.9g/L3-(N-玛琳代)丙磺酸的LB液体培养基。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述LBG培养基中还添加有1％CaCO₃。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述工程菌为热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌，将菌种接入含有抗生素的LB液体培养基中，在≤60℃条件下发酵生产核黄素；

其中，所述LB液体培养基中添加有1‰的金属离子溶液，所述金属离子溶液为0.04MFeSO₄+0.91M MgSO₄+0.59M CaCl₂，以水配制。