[发明专利]一种磷光探针选择性检测凝血酶的方法

说明书

本发明公开了一种磷光探针选择性检测凝血酶的方法。它是利用凝血酶适配体（TBA）与凝血酶之间具有较强的特异性结合，从而使MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点与凝血酶适配体，混合猝灭体系中的TBA离开量子点表面，导致体系磷光强度恢复。相对于荧光量子点，磷光量子点因其磷光寿命长、可避免自体荧光和散色光的干扰、选择性强、检测时无需加入任何除氧剂和诱导剂等优点，在检测中运用更加广泛。在本发明中磷光量子点和TBA均未修饰，很大程度的简化了合成步骤，同时也降低了实验成本。该方法准确度高，灵敏度高，在实际样品的检测中都有很好的应用前景。

本专利受到国家自然科学基金面上项目2137509，天津市自然科学基金青年项目（No.17JCQNJC05800）和天津师范大学博士基金项目（No.52XB1510）的资助。

技术领域

本发明属于生物分析检测技术领域，主要涉及一种免标记磷光探针对凝血酶定量检测的应用。

背景技术

近年来，以掺杂量子点为标记物的荧光分析法已经引起了国内外研究学者的广泛关注，成为当前科学研究的一大热点。在量子点中引入杂质离子会改变量子点的光、电、磁性质。因为掺杂能引起一些在非掺杂量子点中不可能出现的光特性，所以杂质离子对量子点光学性质的改变尤其重要。例如Mn离子掺杂后形成的Mn掺杂ZnS量子点与ZnS量子点相比具有特殊的室温磷光性质。

室温磷光（RTP）量子点检测受到了广泛的关注，已广泛应用于传感器，特别是生物分子传感器。相比较于其他检测模式，磷光检测模式有很多优点。由于磷光寿命的延长，且不受自荧光或散射光的干扰，所以RTP量子点检测具有较高的可靠性和稳定性。此外，由于磷光比荧光更不常见，因此检测选择性进一步增强。RTP传感器的发展前景广阔，因为其他的大多数生物传感器需要进行其他复杂的预处理。RTP传感器大多研究纯猝灭体系，“off-on”体系的研究还很少。

凝血酶（TB）是血液中的丝氨酸蛋白酶，可将可溶性纤维蛋白转化为不溶性纤维蛋白，促进血液凝固。它在多种生命过程中起着重要作用，并与许多疾病有关，如血栓栓塞性疾病、炎症反应、心血管疾病和抗凝血疗法。因此，对凝血酶的敏感性测定在临床研究和诊断中具有重要意义。

凝血酶适配体（TBA）含有15个碱基，其中含有丰富的鸟嘌呤（G），它与凝血酶有较强的特异性结合。TBA被认为是用于临床使用的一种有价值的、经典的凝血酶抑制剂，因为当使用肝素、华法林和比伐卢定，表现出严重的副作用或狭窄的治疗窗。TBA在折叠成一个反平行的结构时，可以强烈且有选择性地识别人凝血酶的纤维蛋白原结合外位点，抑制其在凝固级联中的关键作用。

本发明所用磷光材料与专利ZL 2015 1 0230335.7（磷光量子点在生物体液和酒中选择性检测谷胱甘肽的应用）、ZL 2014 1 0140175.2（一种磷光量子点Mn-ZnS的制备方法及铁形态分析中的应用）中所用一致，但是用于检测的体系的物质不一样。

发明内容

本发明的目的在于克服传统荧光量子点的不足，提供基于磷光量子点为探针检测凝血酶的方法，目的是利用凝血酶适配体（TBA）与凝血酶之间具有较强的特异性结合，从而使MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点与凝血酶适配体（TBA）混合猝灭体系中的TBA离开量子点表面，导致体系磷光强度恢复。相对于荧光量子点，磷光量子点因其磷光寿命长、可避免自体荧光和散色光的干扰、选择性强、检测时无需加入任何除氧剂和诱导剂等优点，在检测中运用更加广泛。

在本发明中磷光量子点和TBA均未修饰，很大程度的简化了合成步骤，同时也降低了实验成本。本发明运用的是“off-on”的磷光检测模式，这种体系可以显著提高检测的灵敏度和选择性。

综上，该方法准确度高，灵敏度高，在实际样品的检测中都有很好的应用前景。为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：