[发明专利]一种利用数字PCR鉴定单拷贝基因突变基因型的方法

说明书

本发明提供一种利用数字PCR鉴定单拷贝基因突变基因型的方法，所述方法包括对样品的待测单拷贝基因突变位点设计数字PCR扩增引物和探针，对样品的单拷贝管家基因设计数字PCR扩增引物和探针，对突变位点和管家基因进行双通道的双重数字PCR反应；和通过单拷贝基因突变位点的数字PCR反应扩增有无确定待测样品是否存在所述单拷贝基因突变位点；如果存在所述单拷贝基因突变位点，通过比较待测单拷贝基因和单拷贝管家基因的拷贝数来鉴定待测单拷贝基因的基因型。本发明方法具有准确、方便、快捷及成本低等特点，可用于遗传病筛查、预防和基因诊断。

技术领域

本发明涉及微液滴数字PCR技术领域，具体涉及一种利用数字PCR鉴定单拷贝基因突变基因型的方法。

背景技术

基因组(Genome)一般定义为单倍体细胞中的所有染色体的全部碱基序列，即单倍体基因组。单拷贝基因是指在单倍体基因组中只存在一份拷贝的基因，单拷贝基因在基因组中占50-80％，如人单倍体基因组中，大约有60-65％的基因序列属于单拷贝基因，例如多数编码蛋白质的基因序列均为单拷贝基因。例如人白细胞抗原HLA基因、遗传性耳聋基因GJB2等。单拷贝基因中储存了巨大的遗传信息，编码各种不同功能的蛋白质。与单拷贝基因相对应的是多拷贝基因，即指在单倍体基因组中存在多份拷贝的基因，例如rRNA基因、tRNA基因等，人的单倍体基因组中约有200个拷贝tRNA基因，某些组蛋白基因也是多拷贝基因。

持家基因(house-keeping genes)，又称管家基因，是指所有细胞中均要稳定表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因、核糖体蛋白基因等。管家基因是一类始终保持着低水平甲基化并且一直处于活性转录状态的基因。管家基因表达水平受环境因素影响较小，而且是在个体各个生长阶段几乎全部组织中持续表达，因此常存在于生物细胞核的常染色质中。它的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。单拷贝管家基因是指在单倍体基因组中存在单个拷贝的管家基因，大多数管家基因是单拷贝基因，例如基因ACTB、ALDOA、GAPD、NPGK1、LDHA、RPS27A、RPL19、RPL11、NONO、ARHGDIA、RPPH1、GAPDH、NAGK、TUFMP1、LINE1、UBBP4、EFTUD2等。

单核苷酸多态性(SNP)主要是指不影响个体功能而且改变的碱基的群体频率不低于1％的单个碱基改变。如果DNA的改变影响了产物(RNA或蛋白)的结构和功能，造成某种疾病或者特定的表型，则称为基因突变。多态性和突变在本质上没有差别，只是频率不同。由于突变多数造成个体的适应性非常低，所以受到负选择的作用而导致频率很低。对于多态性，其频率受到很多因素的影响，包括遗传漂变，群体因素，自然选择等。人的SNP通常表现为等位基因多态性，等位基因(allele)是指位于一对同源染色体相同位置上控制着相对性状的一对基因。如果成对的等位基因中两个成员完全相同，则该个体对此性状来说为纯合子。若两个等位基因不相同，则该个体对该性状来说是杂合子。因此，等位基因的纯合子或杂合子基因型决定生物的性状，而很多疾病与等位基因的基因型密切相关。准确快速地检测等位基因的基因型，对疾病、临床检测和分子诊断等有重大意义。

本发明阐述一种快速检测单拷贝等位基因纯合子和杂合子基因型的新方法，该方法具有准确性高、灵敏度高、操作简易并可定量分析等特点，可用于遗传病筛查、预防和基因诊断。

发明内容