[发明专利]一种利用数字PCR鉴定单拷贝基因突变基因型的方法

权利要求书

1.一种利用数字PCR鉴定单拷贝基因突变基因型的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤一：对样品的待测单拷贝基因突变位点设计数字PCR扩增引物和探针；

步骤二：对样品的单拷贝管家基因设计数字PCR扩增引物和探针；

步骤三：对步骤一的突变位点和步骤二的管家基因进行双通道的双重数字PCR反应；和

步骤四：通过单拷贝基因突变位点的数字PCR反应扩增有无确定待测样品是否存在所述单拷贝基因突变位点；如果存在所述单拷贝基因突变位点，通过比较待测单拷贝基因和单拷贝管家基因的拷贝数来鉴定待测单拷贝基因的基因型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：如果待测单拷贝基因的拷贝数和单拷贝管家基因的拷贝数的比值在1±15％范围内，则判定待测单拷贝基因为纯合型；如果待测单拷贝基因的拷贝数和单拷贝管家基因的拷贝数比值在0.5±15％范围内，则判定单拷贝基因为杂合型。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：如果待测单拷贝基因的拷贝数和单拷贝管家基因的拷贝数的比值在理论值1的90％以上的置信区间内，则判定待测单拷贝基因为纯合型；如果待测单拷贝基因的拷贝数和单拷贝管家基因的拷贝数比值在理论值0.5的90％以上置信区间内，则判定单拷贝基因为杂合型。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：如果待测单拷贝基因的拷贝数和单拷贝管家基因的拷贝数的比值在理论值1的95％的置信区间内，则判定待测单拷贝基因为纯合型；如果待测单拷贝基因的拷贝数和单拷贝管家基因的拷贝数比值在理论值0.5的95％置信区间内，则判定单拷贝基因为杂合型。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测单拷贝基因选自GJB2、SLC26A4、MTRNR1、GJB3、HBA1、HBA2、HBB、PAH、HLA、TRIO、SMN1、DMD中的任一个；和/或单拷贝管家基因选自ACTB、ALDOA、GAPD、NPGK1、LDHA、RPS27A、RPL19、RPL11、NONO、ARHGDIA、RPPH1、GAPDH、NAGK、TUFMP1、LINE1、UBBP4和EFTUD2中的任一个。

6.根据权利要求5所述的方法，所述待测单拷贝基因是HLA-B27，和/或所述单拷贝管家基因是RPPH1、GAPDH或NAGK。

7.根据权利要求6所述的方法，所述待测单拷贝基因是HLA-B27突变位点的数字PCR扩增的上游引物选自SEQ ID NOs：1-9中的任一个；下游引物选自SEQ ID NOs：10-12中的任一个；和检测探针选自SEQ ID NOs：13-16中的任一个。

8.根据权利要求7所述的方法，所述检测探针5’端标记荧光染料，优选的是FAM或VIC荧光染料；和3’端标记MGB。

9.根据权利要求6所述的方法，所述单拷贝管家基因的数字PCR扩增的上游引物选自SEQ ID NOs：17、19、21中的任一个；下游引物选自SEQ ID NOs：18、20、22中的任一个；和检测探针选自SEQ ID NOs：23-25中的任一个。

10.根据权利要求9所述的方法，所述检测探针5’端标记荧光染料，优选的是VIC或TET荧光染料；和3’端标记MGB或BHQ1。