[发明专利]一种自体美容生物材料的制备方法及自体美容生物材料

权利要求书

1.一种自体美容生物材料的制备方法,其特征在于包括以下步骤：

(1)组织采集：从耳后皮肤部位采集样本，用含有抗生素的磷酸盐缓冲液清洗样本后液氮保存；

(2)成纤维细胞分离培养:取出组织，解冻后先用含抗生素的DMEM清洗1-2遍，再使用75％的酒精短时消毒，之后用不含钙和镁离子的磷酸盐缓冲液进行洗涤，然后将组织置于含有胶原酶和分散酶的组合物中进行过夜消化，去除组织块的表皮层；之后将组织剪碎，移至专用培养基中培养10-20天,当细胞融合度达到50％以上时，收获细胞，此时细胞为P0代细胞；

将P0代细胞传代到培养瓶中，再培养3-5天，当细胞融合度达到80％以上时，消化收获细胞，此时细胞为第一代细胞P1；

将第一代细胞传代到培养瓶中，再培养2-3天，当细胞融合度达到85％以上时，消化收获细胞，此时细胞为第二代细胞P2；

将第二代成纤维细胞的1-2×10⁷个细胞转移到自动细胞扩增系统中，在5％CO₂、37℃条件下将第二代细胞继续扩增5-7天，其中所述自动细胞扩增系统培养过程中,根据载入的细胞数量，设置不同的参数:

a.当1500万＞细胞上样量＞500万时,用25mL/min的进样速度、150mL/min循环；

b.当细胞数量大于1500万时,用25mL/min的进样速度、200mL/min循环；

在培养过程中每天检测细胞代谢物中的乳酸值，由乳酸计算值判断培养的细胞达到指数生长末期时，收获细胞，此时收获的细胞为第三代细胞P3，即成纤维细胞；

(3)制备富含血小板的血浆混合物制剂：用制备富含血小板血浆混合物的实施装置制备富含血小板的血浆混合物；

(4)自体美容生物材料的制备：将(2)中制备的成纤维细胞与(3)中的富含血小板血浆混合制备成自体美容生物材料。

2.根据权利要求1所述的自体美容生物材料的制备方法,其特征在于步骤(2)中，通过成纤维细胞专用培养液及限制消化时间来去除上皮细胞及角质细胞，以纯化成纤维细胞。

3.根据权利要求1所述的自体美容生物材料的制备方法，其特征在于:

当适用a时,设置培养液进液速度为25mL/min，逆时针20mL/min循环3min；

当适用b时,设置培养液进液速度为0mL/min，逆时针200mL/min循环4min。

4.根据权利要求1所述的自体美容生物材料的制备方法,其特征在于在步骤(2)中，根据细胞代谢物来计算细胞扩增的理论值，当细胞乳酸检测值达到一定含量时，即可判断细胞处于指数增长末期，即可收获细胞。

5.根据权利要求1所述的自体美容生物材料的制备方法,其特征在于在步骤(2)中，在细胞收获时根据细胞形态的变化来判断何时终止消化,当细胞收缩,漂起的时候立即加成纤维细胞专用培养液终止消化。

6.根据权利要求1所述的自体美容生物材料的制备方法,其特征在于在步骤(2)中，当细胞数量达到2-8×10⁸个细胞，并且细胞仍处于指数生长期时，使用含有EDTA的0.25％胰蛋白酶消化收获细胞，将收获的细胞在无菌磷酸盐缓冲液中洗涤并进行细胞计数，其细胞活性＞95％，具有典型的成纤维细胞形态。

7.根据权利要求1所述的自体美容生物材料的制备方法,其特征在于步骤(1)中的耳后皮肤组织为完整的皮肤组织,包括表皮、真皮、皮下组织三层组成。

8.根据权利要求1所述的自体美容生物材料的制备方法，其特征在于步骤(4)中还包括将冷冻的第三代细胞从液氮存贮器中取出，水浴复苏。

9.根据权利要求1所述的自体美容生物材料的制备方法，其特征在于步骤(4)中成纤维细胞与富含血小板血浆混合前需要分散在无菌生理盐水中。