[发明专利]SpyCas9的基因编辑活性抑制位点及其抑制剂

说明书

本发明公开了SpyCas9的基因编辑活性抑制位点，所述基因编辑活性抑制位点在制备基因编辑相关制剂中的用途，以及能够抑制SpyCas9的基因编辑/核酸酶活性的抑制剂。本发明为开发SpyCas9活性抑制剂与相关技术以及产品提供了基础。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年4月26日提交的申请号为201710284103.9的中 国专利申请的权益，在此将其全部内容引入作为参考。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及SpyCas9的基因编辑 活性抑制位点及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas9技术是近年来发展起来的一种新的基因编辑技术。在打靶 过程中，CRISPR/Cas9系统通过sgRNA-Cas9体系使间区序列邻近基序 (Protospacer AdjacentMotif,PAM)3’端与sgRNA互补的目标DNA产生双 链断裂(Double-Strand Breaks，DSB)，之后细胞通过非同源末端连接(Non- Homologous End Joining，NHEJ)或者同源介导的双链DNA修复 (Homology-Directed Repair，HDR)对DNA进行修复，以实现对基因组的 改造。

基于对Cas蛋白的识别，CRISPR/Cas9系统可分成I至VI 6种类型与 19种亚型。目前已得到充分表征的SpyCas9系统属于II型CRISPR系统， 其通过PI结构域识别PAM区段而招募靶标双链DNA(dsDNA)。SpyCas9 与sgRNA相组合，已用作基因组编辑和基因调节中的最常见和有力的工具。

然而，目前仍然缺乏控制SpyCas9活性、由此降低由过度SpyCas9活性 导致的编辑脱靶的工具。并且，虽然目前已发现一些抗CRISPR蛋白，例如 由Listeria monocytogenes噬菌体原编码的4种抗CRISPR蛋白，特别是 AcrIIA2和AcrIIA4，可以使Listeriamonocytogenes Cas9(LmoCas9)的II-A CRISPR-Cas9和体内SpyCas9失活，但对于SpyCas9的活性位点以及与其相 关联的抑制剂，仍有待阐释与开发。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的发明人通过解析AcrIIA4与SpyCas9 的复合物结构，并进行深入表征，发现AcrIIA4直接和SpyCas9PI结构域上 的PAM DNA识别氨基酸结合从而抑制SpyCas9活性，所述PAM DNA识别 氨基酸包括Glu1108、Ser1109、Ser1216、Lys1200、Arg1335、Arg976和Arg1333 等，这是SpyCas9基因编辑活性抑制位点的首次发现。

因此，本发明的一个目的是提供SpyCas9的所述基因编辑活性抑制位 点。

本发明的另一个目的是提供该抑制位点的用途，例如针对该位点制备基 因编辑相关制剂。

本发明的又一个目的是提供能够抑制SpyCas9的基因编辑/核酸酶活性 的抑制剂。

本发明的还一个目的是提供抑制SpyCas9的基因编辑的方法。

本发明的技术方案如下。