[发明专利]乳腺癌的双靶点CAR-T治疗载体及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及提供了乳腺癌的双靶点CAR‐T治疗载体及其构建方法和应用。双靶点CAR‑T治疗载体由慢病毒表达载体pCDH‑EF1α‑MCS‑(PGK‑Puro)和CAR结构两部分构成。所述的CAR结构具体为Igkappa‑iRGD‑mesothelin scFv‑(G₄S)₅‑CD133scFv‑CD8α‑CD28‑CD137‑CD3ζ‑2A‑CCL19。以病毒感染方式获得含有该治疗载体的T细胞，即CAR‑T细胞(Chimeric Antigen Receptor T‑Cell)，通过表达CAR结构，可靶向识别和杀伤乳腺癌细胞。

技术领域

本发明涉及一种CAR-T治疗载体，尤其是涉及乳腺癌的双靶点CAR-T治疗 载体及其构建方法和应用。

背景技术

乳腺癌做为一种威胁女性身心健康的常见肿瘤，其发病率约占全身恶性肿瘤 的23％，死亡率占14％。目前乳腺癌的治疗方法主要包括手术、放疗、化疗或联 合治疗，但治疗效果有限；基因治疗做为新型治疗手段，由于无法确定靶向致病基 因，目前尚无突破性进展。其次，肿瘤异质性和肿瘤微环境的复杂性意味着依靠单 一方法治愈乳腺癌的机会是微乎其微的。在多学科综合治疗的今天，新的治疗方式 亟待提出。

CAR-T细胞疗法是通过基因工程技术在T细胞表面人为过表达能识别特定的 肿瘤表面抗原的单链抗体可变区基因片段，从而使T细胞识别特定抗原、杀伤表 达该抗原的靶细胞。同时，由于CAR-T细胞是采用抗体识别抗原模式，因此不受 主要组织相容性复合物(main histocompatibility complex，MHC)的限制。近年来， CAR-T细胞在血液肿瘤治疗中取得了令人振奋的效果，如对晚期复发难治性急性 淋巴细胞白血病(ALL)治疗的完全缓解(CR)可达到90％，对慢性淋巴细胞白 血病(CLL)和部分B细胞淋巴瘤的CR达到50％以上。在治疗实体瘤方面，其 安全性和有效性已得到证实。

中国专利CN107557388A公布了用于CAR-T细胞制备的慢病毒载体及其构建 方法和在制备抗肿瘤细胞制品中的应用，同时还建立了荧光定量PCR检测病毒滴 度的方法，为临床应用提供了检测标准。

中国专利CN107446938A公布了一种特异性靶向受体蛋白MAGEA及其CAR -T载体的构建方法，所述构建方法包括，先提取抗骨肉瘤的单克隆杂交瘤细胞的 RNA，然后用单克隆抗体的特异性引物进行RT-PCR，将抗体重链和轻链的可变区 DNA片段克隆到T载体上，测序，获得特异性识别肿瘤细胞的受体蛋白MAGEA， 并将其表达序列克隆到CAR-T载体上，获得特异性靶向MAGEA的新型CAR-T 载体。该发明能够为CAR-T细胞治疗的实体肿瘤，尤其是在骨肉瘤的免疫治疗上 提供了有效的靶标。

中国专利CN107325185A公布了一种基于OCTS-CAR的PSCA及PDL1双靶 向嵌合抗原受体、编码基因、OCTS-CAR-T重组表达载体及其构建方法和应用。 该抗PSCA及PDL1双靶向嵌合抗原受体包括依次串联连接的CD8 leader膜受体信 号肽、双抗原结合区、CD8 Hinge嵌合受体铰链、CD8 Transmembrane嵌合受体跨 膜区、CD28嵌合受体共刺激因子、OX40嵌合受体共刺激因子以及TCR嵌合受体 T细胞激活域，其中，双抗原结合区包括以串联或转角连接方式连接的PSCA以及 PDL1单链抗体的重链VH和轻链VL、抗体内铰链Inner-Linker以及单链抗体间铰 链Inter-Linker。此外，还提供了编码该抗PSCA及PDL1双靶向嵌合抗原受体的 基因，重组表达载体及其构建方法和应用。

上述专利均是关于CAR-T细胞疗法的相关研究，但是目前缺少对于乳腺癌进 行双靶点CAR-T治疗的载体或相关研究。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供乳腺癌的双靶点CAR-T治疗载体及其构建方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：