[发明专利]乳腺癌的双靶点CAR-T治疗载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包括mesothelin单链抗体、CD133单链抗体和趋化因子CCL19三个特异性结构，

其中，mesothelin单链抗体结构是针对乳腺癌细胞表面肿瘤相关抗原mesothelin设计的特异性抗原结合域，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，

CD133单链抗体结构是针对乳腺癌细胞表面肿瘤相关抗原CD133设计的特异性抗原结合域，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

趋化因子CCL19核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

2.根据权利要求1所述的一种嵌合抗原受体，其特征在于，嵌合抗原受体结构组成为Igkappa-iRGD-mesothelinscFv-(G₄S)₅-CD133scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ-2A-CCL19。

3.根据权利要求2所述的一种嵌合抗原受体，其特征在于，

iRGD核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，

mesothelinscFv表示mesothelin单链抗体，

(G₄S)₅为单链抗体间铰链Inner-Linker，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，

CD133scFv表示CD133单链抗体，

CD8α为跨膜区，连接胞外抗原结合域和胞内信号域，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，

CD28-CD137为共刺激结构域，CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CD137核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，

CD3ζ为信号转导域，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，

T2A为linker，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

4.一种乳腺癌的双靶点CAR-T治疗载体，其特征在于，包含权利要求1-3中任一项所述嵌合抗原受体，以及载体。

5.根据权利要求4所述乳腺癌的双靶点CAR-T治疗载体，其特征在于，所述载体包括PUC19质粒、慢病毒表达载体。

6.根据权利要求5所述乳腺癌的双靶点CAR-T治疗载体，其特征在于，所述慢病毒表达载体为pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)。

7.一种如权利要求5或6所述乳腺癌的双靶点CAR-T治疗载体的构建方法，其特征在于，

将嵌合抗原受体结构按照基因序列，采用常规生物合成方法进行合成，合成后存在于PUC19质粒载体上；将PUC19质粒载体和慢病毒表达载体均采用ECoR Ⅰ、Not Ⅰ双酶切，将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的条带，得出载体和目的片段的浓度，将两者按照摩尔比为1:5进行连接转化，质粒提取，最终获得含有嵌合抗原受体结构的重组质粒，即所述乳腺癌的双靶点CAR-T治疗载体。

8.一种如权利要求5或6所述乳腺癌的双靶点CAR-T治疗载体的应用，其特征在于，用于构建CAR-T细胞，

将该治疗载体采用三质粒包装系统进行慢病毒包装，组成为PSPAX2、pMD2G、乳腺癌的双靶点CAR-T治疗载体，使用293T细胞作为慢病毒的包装细胞，培养，收集病毒液，将此病毒液浓缩后，感染T细胞，即可获得CAR-T细胞。

9.根据权利要求8所述乳腺癌的双靶点CAR-T治疗载体的应用，其特征在于，PSPAX2、pMD2G、乳腺癌的双靶点CAR-T治疗载体在体系中有固定的含量比例。

10.一种CAR-T细胞，其特征在于，采用权利要求8的应用方法制备得到。