[发明专利]一种定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法

说明书

本发明公开了一种定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法，属于生物检测技术领域。本发明利用具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白不能被胰蛋白酶酶解，而三股螺旋结构破坏的胶原蛋白能被胰蛋白酶酶解的原理，通过测定胰蛋白酶酶解前后胶原蛋白溶液体系中胶原蛋白的特征氨基酸—羟脯氨酸的含量变化，计算得胶原蛋白完整三股螺旋结构的含量。本发明可以通过定量检测胶原蛋白三股螺旋，从而定量的判断胶原蛋白在各种工艺条件下三股螺旋结构破坏的程度，弥补了定性检测的不足，适用于含胶原蛋白的复杂生物体系，特异性强，结果重现性好，操作简单，可作为胶原类产品开发过程检测的应用手段。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法。

背景技术

胶原蛋白是脊椎动物细胞外基质中的一个重要组成部分，是哺乳动物中最丰富的蛋白质，约占总蛋白含量的20％～30％。由于胶原蛋白具有显著的成纤维结构，良好的生物降解性，优越的生物相容性及较低的抗原性等优点，其已经广泛运用到美容业、制药业、食品、生物医学领域上。胶原蛋白的三股螺旋结构，使细胞能吸附、迁移于胶原蛋白基上，甚至调节和促进细胞的分化，作为重要的细胞外基质，胶原蛋白有助于维持组织或器官的稳定性，并维持它们功能的完整性。可见，三股螺旋结构是胶原蛋白生物活性的一个重要标志，是其发挥功能特性的前提。然而，天然的胶原蛋白的三股螺旋结构极易受加工环境的影响，在胶原蛋白生产加工不可避免会引入物理热、机械搅拌、剪切、化学试剂等，这会对胶原蛋白的三股螺旋结构造成部分破坏甚至完全破坏，导致其失去天然的生物活性功能。

目前，胶原蛋白三股螺旋结构定性的检测方法主要为圆二色谱法、红外光谱法，如胶原蛋白的圆二色谱特征为：在约198nm处有一个强的负吸收，在约220nm处有一个较弱的正吸收，吸收的强度能反应胶原蛋白三螺旋结构的保留程度；又如红外光谱法通过观测特定键能的吸收反应蛋白质的二级结构变化。然而，以上方法都只能通过与参照物对比，定性的判断胶原蛋白中三螺旋结构的破坏程度，而无法定量检测三股螺旋结构的含量。

除此之外，专利号CN 106383232“一种利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法”公开了一种胶原蛋白三重螺旋结构的检测方法，但是该方法存在如下缺陷：1)制备荧光探针时操作复杂；2)该方法通过探针多肽与待测多肽形成胶原蛋白三重螺旋结构，进而检测此三重螺旋结构，并非检测体系中本存在的胶原蛋白三股螺旋结构；3)众所周知，粘度大是胶原溶液的一个特性，但该方法较难测定高粘度的胶原体系中三股螺旋结构的含量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法，在胶原蛋白样品液中加入胰蛋白酶进行酶解反应后，利用三氯乙酸沉淀法分离出具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白，通过测定酶解前后胶原蛋白中羟脯氨酸的含量，计算酶解后分离出具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白中羟脯氨酸的含量与酶解前胶原蛋白中羟脯氨酸的含量的比值，从而得到样品中具有三股螺旋结构的胶原蛋白的含量。

本发明利用具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白不能被胰蛋白酶酶解，而三股螺旋结构完全破坏或部分破坏的胶原蛋白能被胰蛋白酶酶解的原理，通过检测胰蛋白酶酶解前后胶原蛋白溶液体系中胶原蛋白的特征氨基酸—羟脯氨酸的含量变化，计算得到胶原蛋白中具有完整三股螺旋结构的含量。本发明的检测方法弥补了现有技术仅能定性检测胶原蛋白三股螺旋结构的缺陷，且操作方法简单，不受胶原体系粘度大的影响。

作为本发明所述的定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法的优选实施方式，包含以下步骤：

(1)将样品液的pH调节为3.6～3.7，备用；

(2)将胰蛋白酶液加入样品液中，混合均匀，得到待酶解体系液；