[发明专利]一种定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法

权利要求书

1.一种定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法，其特征在于，在胶原蛋白样品液中加入胰蛋白酶进行酶解反应后，利用三氯乙酸沉淀法分离出具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白，通过测定酶解前后胶原蛋白中羟脯氨酸的含量，计算酶解后分离出具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白中羟脯氨酸的含量与酶解前胶原蛋白中羟脯氨酸的含量的比值，从而得到样品中具有三股螺旋结构的胶原蛋白的含量；所述酶解前胶原蛋白中羟脯氨酸的含量为酶解前待酶解体系中羟脯氨酸的含量，包含具有完整三螺旋结构的胶原蛋白与三螺旋结构被破坏的胶原蛋白中羟脯氨酸的总和；所述酶解后胶原蛋白中羟脯氨酸的含量为酶解后溶液经三氯乙酸分离后的具有完整三螺旋结构胶原蛋白中羟脯氨酸的含量。

2.根据权利要求1所述的定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)将样品液的pH调节为3.6～3.7，备用；

(2)将胰蛋白酶液加入样品液中，混合均匀，得到待酶解体系液；

(3)称取部分待酶解体系液，加入盐酸溶液，水解后，测定水解液中羟脯氨酸的含量，得到酶解前待酶解体系液中羟脯氨酸的含量；

(4)将取样后的待酶解体系液置于恒温振荡条件下进行酶解反应；

(5)称取与步骤(3)所述部分待酶解体系液相同体积的酶解后溶液，利用三氯乙酸沉淀法处理分离出具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白沉淀与上清液，将沉淀或上清液水解后，测定水解液中羟脯氨酸的含量，计算具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白中羟脯氨酸的含量与酶解前胶原蛋白中羟脯氨酸的含量的比值。

3.根据权利要求2所述的定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，胰蛋白酶液的配置方法为：称取胰蛋白酶，加入含0.05M CaCl₂的0.001M HCl溶液中。

4.根据权利要求2所述的定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，胰蛋白酶与样品液总蛋白的质量比1:20～1:100。

5.根据权利要求2所述的定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，酶解温度为15～30℃，振荡转速为50～120rmp，酶解时间为1～24h。

6.根据权利要求2所述的定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，处理分离出具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白沉淀与上清液的步骤为：往酶解后溶液中加入4℃的质量浓度为10％～30％的三氯乙酸溶液，酶解后溶液与三氯乙酸溶液的质量比为1：0.5～2，振荡10s混合均匀后，在4℃，5000rmp离心10min。

7.根据权利要求6所 述的定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，选择沉淀处理：弃去上清液，用4℃的质量浓度为10％的三氯乙酸溶液清洗沉淀表面3次后，加入盐酸溶液，水解，测定水解液中羟脯氨酸的含量。

8.根据权利要求6所 述的定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，选择上清液处理：称取上清液，加入盐酸溶液，水解，测定水解液中羟脯氨酸的含量。