[发明专利]一种烟草根黑腐病菌的分离方法

说明书

一种烟草根黑腐病菌的分离方法，采集具有烟草根黑腐病症状的烟草植株的根际土壤，将采集的根际土壤干燥磨碎后粘附于胡萝卜片上，然后将粘附有土壤的胡萝卜片放置在培养皿中培养2—4天，之后用加有50μL/mL青霉素和50μL/mL硫酸链霉素的无菌水冲洗胡萝卜片，继续培养2—4天后，挑取胡萝卜片上具有烟草根黑腐病典型病症的霉层，纯化培养后保存。利用胡萝卜片成分对烟草根黑腐病菌和其它真菌的不同影响，诱导烟草根黑腐病菌生长而抑制其它菌的生长，解决烟草根黑腐病菌易被其它真菌掩盖的问题。处理后的胡萝卜圆片表面可很快长出菌丝与典型的分生孢子梗、分生孢子及厚垣孢子，成功率达96%以上。

技术领域

本发明涉及一种病菌分离方法，具体地说是一种烟草根黑腐病菌的分离方法。

背景技术

植物病原真菌的分离、纯化培养不仅是进行病原真菌的形态学观察、致病性测定、生理生态与分子生物学等理论性研究的基础，也是进行品种抗病性鉴定和筛选、病原菌耐（抗）等应用性研究的基础。植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，一般都能恢复生长和繁殖。然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其它基物中将病原菌单独分离出来，称作植物病原真菌的分离。植物病原真菌的分离不仅在植物病理学研究工作中具有十分重要的位置，而且对分离到的病原真菌进行保存可以满足植物病理学及微生物学日常的教学需要，使学生对植物病原真菌有更直观的认识。

烟草根黑腐病由根串珠霉(Thielaviopsis basicola) 侵染引起，在我国云南、贵州、四川、重庆、湖北、河南、山东、安徽、福建和吉林等省也均有发生，重病烟田发病率达30%以上。由于串珠霉与烟草寄生疫霉（Phytophthora spp.）、腐霉菌（Pythium spp.）、镰刀菌（Fusarium spp.）、丝核菌（Rhizoctonia spp.）等病原真菌复合侵染引起烟草根茎部病害，给生产上准确诊断病害造成困难，明确本地病原菌的种类及其致病力是指导病害防治以及进行后续研究的基础。

目前，从染病植株上分离病原菌通常采用组织分离法，在病株发病部位的病、健交界处切下4-5块3×3mm的组织小块，分离过程中需要依次用70%酒精（或0.1%升汞）及3%-5%次氯酸钠消毒，还需要用无菌水多次清洗，以及用滤纸吸干离。用酒精和次氯酸钠消毒，以及无菌水清洗时都需要用到培养皿，每次消毒及清洗培养皿均需更换一次，1个病株需要5副培养皿才可以分离完毕，操作过程复杂，而且所需耗材及试剂多，成本较高。

而且，由于烟草根黑腐病菌属于兼性寄生真菌，且与腐霉菌等其它几类真菌相比生长速度较慢，采用常规的病组织分离法分离极容易被其它真菌掩盖，很难获得纯培养病原物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服常规分离方法所需耗材及试剂多，难以获得纯培养病原物的缺陷，提供一种烟草根黑腐病菌的分离方法。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种烟草根黑腐病菌的分离方法，采集具有烟草根黑腐病症状的烟草植株的根际土壤，将采集的根际土壤干燥磨碎后粘附于胡萝卜片上，然后将粘附有土壤的胡萝卜片放置在培养皿中培养2—4天，之后用加有50μL/mL青霉素和50 μL/mL硫酸链霉素的无菌水冲洗胡萝卜片，继续培养2—4天后，挑取胡萝卜片上具有烟草根黑腐病典型病症的霉层，纯化培养后保存。

进一步地，所述的根际土壤为距烟草根系表面2 mm以内的土壤。

进一步地，所述的胡萝卜片的厚度为4-6 mm。

进一步地，所述的胡萝卜片为新鲜胡萝卜用浓度75%酒精进行表面消毒后，使用灭菌刀切成的圆片。

进一步地，先在培养皿中铺设浸过蒸馏水的脱脂棉及滤纸，然后再将粘附有土壤的胡萝卜片放于其中培养。