[发明专利]基于囊泡检测EML4-ALK融合基因的引物和试剂盒

说明书

本发明提供一套基于囊泡无创检测EML4‑ALK融合基因的引物。本发明还提供用于qPCR或数字PCR检测EML4‑ALK融合基因的引物和探针，序列如SEQ ID NO:1‑5所示。利用所述引物和探针建立了一种基于囊泡的无创、快速、高灵敏度的EML4‑ALK融合基因突变检测方法。本检测方法针对体液标本(包括血液、胸腔积液、腹水及脑脊液等)，临床样本易获取。本方法检测灵敏度高，包含10个拷贝的EML4‑ALK突变即可稳定检出，可提供精确的用药指导。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及一种基于囊泡无创检测 EML4-ALK融合基因的引物和试剂盒。

背景技术

《2017中国肿瘤登记年报》数据显示，我国肺癌发病率、死亡率在所有恶性肿瘤中均排在第一位。初诊患者中，I期肺癌患者比例仅为15-20％，多数病人不具备手术条件，药物治疗依旧是肺癌的主要治疗手段。近年来，分子靶向药物因特异性高，毒副作用低，正逐渐替代传统化疗药物成为肺癌治疗的首选方案。以非小细胞肺癌 (NSCLC，约占肺癌总数85％)为例，根据流行病学研究结果，约3-5％的NSCLC患者携带有EML4-ALK融合突变。其中，EML4是棘皮动物微管蛋白4，ALK是间变性淋巴瘤激酶。当这两个基因发生倒位融合后，会表达EML4-ALK融合蛋白，该蛋白可以形成二聚体并持续激活ALK信号通路。2011年8月，距离这一治疗靶点被发现后仅4年，FDA就批准通过了首个ALK抑制剂药物(Crizotinib)。III期临床试验结果显示，受试者有着65％的总体响应率以及7.7个月的无进展生存期。当Crizotinib产生耐药性后，新一代ALK抑制剂，如Ceritinib和Alectinib，被证实可以让患者疾病得到有效控制。目前，已经发现的ALK融合变体不少于15种，在以ALK重排为靶点的治疗方案不断推陈出新的同时，如何精准地找到适用患者，对于提高治疗效果尤为重要。

胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是指从细胞膜上脱落或由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体，其主要类型包括外泌体(Exosome,粒径50-100nm)、微泡(Microvesicle，粒径20-1000nm)以及凋亡小体(Apoptotic blebs，粒径1000-5000nm)。胞外囊泡作为细胞间信息传递的重要媒介，在抗原呈递、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤发生发展及转移过程中均发挥着重要作用。此外，因其在体液中分布广泛(如血液、唾液、尿液、乳汁和胸腹水等)，且包含DNA、RNA及蛋白质等多种内含物，为我们从分子水平对患者病情进行实时动态地监测提供了机会，因而在精准医疗领域有着巨大的应用前景。

目前，临床上使用的EML4-ALK融合检测方法包括，荧光原位杂交FISH(Vysis ALKBreak Apart FISH Probe Kit，雅培)、免疫组化IHC(VENTANA ALK(D5F3)CDx Assay，罗氏)以及RT-PCR(EML4-ALK融合基因检测试剂盒，厦门艾德)。 FISH是利用荧光探针对ALK序列上可能发生断点的位置进行标记，并根据存在断点异常的肿瘤细胞比例来判断是否为融合阳性，其优点在于能涵盖多种融合类型，然而根据杂交荧光探针的间距来判断阴/阳性细胞难免会有主观因素的干扰，此外昂贵的设备及试剂成本偏高也限制了该方法在临床中的推广。IHC同样不局限于融合类型，而且相比FISH不仅操作简单更具有价格优势，但包括冷缺血、样本固定方式、保存时间，甚至抗体选择等因素都能够对检测结果造成不同程度的影响。此外，上述两种方法还存在一个共同的问题，无法确认具体的融合类型。基于组织的RT-PCR 检测具有较高的灵敏度和特异性，能够检测已有引物序列所对应的融合类型，但因为检测的是RNA，因此对组织的新鲜程度和保存方式也存在较高要求。总体来说，上述三种方法都是依赖活检组织的有创检测，对于样本的采集和保存有着不同程度的要求。对于某些难以得到活检组织的患者，这些方法均无法提供有效的检测。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测EML4-ALK融合基因的引物。