[发明专利]多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及其免疫效力分析

说明书

本发明公开了一种多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及其免疫效力分析方法，制备多杀性巴氏杆菌菌影，对菌影裂解率最高时的诱导时间和起始诱导浓度进行诱导，将诱导后的菌液离心收集菌体沉淀。然后用无菌PBS重悬菌体制得菌影疫苗及灭活疫苗；最后应用制备的菌影疫苗对小鼠进行免疫接种。结果显示，制备的菌影疫苗可诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫，可为小鼠抵抗多杀性巴氏杆菌的攻击提供较高的保护力。本发明为进一步研究动物巴氏杆菌菌影疫苗奠定了基础。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及其免疫效力分析方法。

背景技术

动物的巴氏杆菌病是由巴氏杆菌感染引起的一种急性传染病。目前该病的预防主要靠疫苗接种，其疫苗主要包括灭活菌苗，弱毒活菌疫苗和亚单位疫苗。由于传统灭活疫苗的免疫效果不理想，不能提供较强的保护力，弱毒活菌疫苗存在毒力返强的风险，因此研制一种安全有效的疫苗对控制动物巴氏杆菌病具有重要意义。

细菌菌影技术是近年来兴起的一种新型疫苗技术，适用于大部分的革兰氏阴性菌。它是利用噬菌体phi X174裂解基因在细胞膜上形成特异性跨膜孔道，并通过渗透压作用排出胞质内含物，从而形成的完整细菌空壳。它完整的保留了细菌表面抗原的天然结构，可以有效诱导机体产生较强的免疫反应，同时由于其不含有任何的胞质内容物和核酸，因此比弱毒疫苗和灭活疫苗更安全可靠。目前的研究已经表明，菌影既可以诱导机体产生体液免疫，又可以产生细胞免疫，因此是一种非常理想的新型细菌疫苗。

发明内容

本发明针对现有疫苗技术的不足，目的在于提供一种多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及其免疫效力分析方法，从而成功构建了裂解质粒pPBA1100-E，并获得多杀性巴氏杆菌菌影疫苗，可为小白鼠提供良好的免疫保护，为进一步研究动物用多杀性巴氏杆菌菌影疫苗奠定基础。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及其免疫效力分析方法，包括以下内容：首先以pHH43质粒为模板，通过PCR扩增含噬菌体PhiX174的裂解基因E和CI857-PL-PR启动阻遏系统组成的温敏裂解盒

CI857-PL-PR-E，再将裂解盒插入到pPBA1100载体中，构建裂解质粒pPBA1100-E。利用电转化的方法将其转入多杀性巴氏杆菌中，将含有裂解质粒的多杀性巴氏杆菌在37℃条件下培养至OD_600nm值约为0.4时，再将培养温度升至42℃进行诱导，制备多杀性巴氏杆菌菌影；其次应用制备的菌影疫苗对80只25g左右的雌性昆明系小白鼠进行免疫接种，分析菌影疫苗对小鼠的免疫效力。

上述方案中，所述的多杀性巴氏杆菌菌影制备步骤如下：

(1)以pHH43质粒为模板，通过PCR扩增含噬菌体PhiX174的裂解基因E和CI857-PL-PR启动阻遏系统组成的温敏裂解盒CI857-PL-PR-E；

(2)将步骤(1)制得的温敏裂解盒CI857-PL-PR-E插入到pPBA1100载体中，构建裂解质粒pPBA1100-E；

(3)将步骤(2)制得的裂解质粒pPBA1100-E利用电转化的方法将其转入多杀性巴氏杆菌中；

(4)步骤(3)制得的含有裂解质粒的多杀性巴氏杆菌在37℃条件下培养至OD_600nm值约为0.4时，将培养温度升至42℃进行诱导，制备多杀性巴氏杆菌菌影，菌影冻干保存。

上述方案中，所述的裂解质粒pPBA1100-E的构建方法如下：

(1)以pHH43质粒为模板扩增裂解盒：

根据pHH43质粒的测序结果设计引物扩增裂解盒，即温控原件和裂解基因E。