[发明专利]一种生产低温甾醇酯酶的菌株及其发酵方法

权利要求书

1.一种生产低温甾醇酯酶的菌株，其特征在于，命名为Q-06，该菌株来自对原始菌株Pseudomonas fragi低温驯化。

2.如权利要求1所述的生产低温甾醇酯酶的菌株，其特征在于，

菌落形态特征为：所述菌株在甾醇酯培养基上生长良好，单菌落近似圆形，边缘整齐，表面隆起，呈淡黄色，不透明，用接种环易于挑取，中心有光泽；菌体形态特征为：菌株呈杆状，多为单个排列，革兰氏染色结果呈阴性；

主要生理生化特征：氧化酶试验、接触酶试验呈阳性，能够氧化分解葡萄糖，能够生成吲哚乙酸，不能生成硫化氢，不能水解淀粉，硝酸盐还原试验、伏普（VP）试验、甲基红（MR）试验、明胶水解试验均呈阴性，精氨酸双水解酶试验呈阳性反应；

遗传学特征：

所述低温甾醇酯酶生产菌Q-06，即Pseudomonas fragi Q-06的16S rDNA全基因序列共1489bp。

3.如权利要求1所述生产低温甾醇酯酶的菌株Q-06生产低温甾醇酯酶的发酵方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）对菌株Pseudomonas fragi（CGMCC NO.1.3349）进行低温驯化得到菌株Q-06，驯化温度由高到低为：30℃→28℃→26℃→24℃→22℃→20℃→18℃；

2）将1）低温驯化得到的菌株Q-06，接种于固体种子培养基用于生产甾醇酯酶，在18～24℃培养48-96小时；

3）将低温菌株Q-06在18~24℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；

4）将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的5～10%接种量接入液体发酵产酶培养基中，在18~24℃培养48～120 h时，即海洋微生物发酵生产低温甾醇酯酶结束；

5）将4）的发酵液在8,000～12,000 rpm离心收集上清液，收集到的液体即为粗酶液。

4.如权利要求4所述的生产低温甾醇酯酶的菌株Q-06生产低温甾醇酯酶的发酵方法，其特征在于，根据不同需要和使用对象不同，将步骤5）得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。

5.按照权利要求4所述的方法，其中低温驯化培养基、固体种子培养基、液体种子培养基、发酵培养基分别为：

步骤1）中驯化所用的低温驯化培养基为：植物甾醇酯10.0~30.0g，酵母粉5.0~10.0g，KH₂PO₄2.0~5.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5~1.5g，(NH₄)₂SO₄1.0~3.0g，葡萄糖5.0~15.0g，琼脂粉18.0~20.0g，自来水1.0L，pH值6.0~8.0，于0.1 MPa、121℃高压蒸汽灭菌30 min；

步骤2）所用固体种子培养基为：酵母膏5.0~10.0g，蛋白胨3.0g~5.0g，NaCl5.0~7.0g，K₂HPO₄1.0~3.0g，FeSO₄·7H₂O0.05~0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.1~0.3 g，琼脂粉18.0~20.0g，自来水1.0L，pH值6.0~8.0，于0.1 MPa、121℃高压蒸汽灭菌30 min；

步骤3）培养所用液体种子培养基为：酵母膏5.0~10.0g，蛋白胨3.0g~5.0g，NaCl5.0~7.0g，K₂HPO₄1.0~3.0g，FeSO₄·7H₂O 0.05~0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.1~0.3 g，自来水1.0L，pH值6.0~8.0，于0.1 MPa、121℃高压蒸汽灭菌30 min；

步骤4）所用发酵产酶培养基为：植物甾醇酯5.0~15.0g，酵母粉3.0~5.0g，KH₂PO₄ 1.0~2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.3~0.5g，(NH₄) ₂SO₄ 0.5~1.0 g，葡萄糖5.0~10.0 g，自来水1.0L，pH6.0~8.0，于0.1MPa、121℃高压蒸汽灭菌30 min。