[发明专利]一种检测鸡滑液囊支原体抗体的试剂盒及制备方法

说明书

本发明提供一种检测鸡滑液囊支原体抗体的ELISA试剂盒。该试剂盒是基于鸡滑液囊支原体丙酮酸激酶(PYK)重组蛋白为包被抗原建立的检测鸡滑液囊支原体抗体的ELISA试剂盒。本发明还提供了用于制备上述试剂盒包被抗原即PYK蛋白的制备方法，通过本发明提供的方法制备的PYK蛋白具有良好的反应原性，且本发明所建立的ELISA检测试剂盒为鸡滑液囊支原体的诊断及免疫后抗体水平的检测提供了有效的方法，为该疾病的预防研究起到了显著促进作用。

技术领域

本发明涉及一种细菌试剂盒及其制备方法，确切的讲是一种检测鸡滑液囊支原体抗体的ELISA试剂盒。

背景技术

支原体(Mycoplasmal)是一类无细胞壁及前体，细胞器极少，呈高度多形性，能在无生命培养基中生长繁殖的最小原核细胞型的微生物。禽类支原体主要涉及家禽，广泛寄生于家禽的呼吸道、泄殖腔、消化道、输卵管粘膜及关节囊中。目前鉴定命名的禽类支原体共有29中，其中属于支原体属的有25中、无胆甾原体3种、脲原体1种。在这些支原体中，同时能感染鸡、火鸡且致病的支原体主要有鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae，MS)。但同致病力强的MG相比，养殖户对MS的认识、检测及防控远远不足，导致MS感染正在从非典型的上呼吸道亚临床症状转向严重的呼吸系统疾病，如气囊炎；当合并其他致病因子，如鸡新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、低致病性禽流感病毒或大肠杆菌感染时，会使病情恶化；此外，MS引起的传染性滑膜囊炎、蛋壳形状畸形及自身免疫性疾病同样威胁着全球家禽养殖业的健康发展。在18届世界禽病大会上，就有专家提出“现在以及不远的将来MS的危害会超过MG”的观点。最新的流行病学调查显示，在东欧、荷兰、墨西哥、阿根廷，MS感染可引起严重的呼吸系统疾病和关节滑膜炎；在我国，MS的发病率亦呈明显上升趋势，加上环境及鸡群状态不良等不利因素，导致MS感染在鸡群中爆发的现象日趋严重。

目前检测MS的方法包括：支原体的分离培养、血清学抗体检测及分子基因诊断，其中分离培养是诊断支原体感染性疾病的金标准，但支原体对培养基的营养要求高，生长缓慢，分离难度大，只适用于实验室检测；血清学检测如平板凝集试验(SPA)特异性低，而血凝抑制试验(HI)敏感性较低，需多次采样，更适合群体水平的检测，并且结果的差异与抗原菌株的来源密切相关；聚合酶链反应(PCR)和实时荧光定量PCR(real-time PCR)是目前应用最多的诊断方法，但是也存在操作步骤多，成本高，耗时长的问题(至少4.5小时)，不易现场进行操作和向基层推广；目前国外商业化鸡滑液囊支原体间接ELISA试剂盒，主要来自美国和欧洲，虽然特异性高，对不同菌株感染的抗体检测敏感度不够，特别是价格昂贵，一份血样的检测费用高达11.5元，限制了养殖户的使用，仅限实验室研究用。目前国内仍没有使用高效表达的重组蛋白做包被抗原进行ELISA检测的、廉价的、特异性好、敏感性高的试剂盒的研制。随着MS蛋白质组学研究的深入，更多滑液囊支原体致病和免疫相关的蛋白质被鉴定，Bercic等人(2008)对滑液囊支原体分离株的主要免疫原性蛋白质进行了鉴定，鉴定出包括MSPA、EF-Tu等的免疫原性蛋白质，其中丙酮酸激酶PYK也是MS重要的免疫原性膜蛋白，序列分析显示在MS中具有高保守性。体外表达PYK重组蛋白作为包被抗原建立ELISA方法开发抗体检测试剂和用于该病的检测具有现实意义。目前MS感染在我国家禽养殖场发生与联系，因此，研制特异、灵敏、廉价、简便的试剂盒是我国当前防控该病的迫切要求。

发明内容

本发明克服现有技术的不足，提供一种准确检测鸡滑液囊支原体抗体的试剂盒，以及这种检测试剂盒的制备方法。

包括一种鸡滑液囊支原体PYK蛋白的制备与纯化方法，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示；研究发现，该蛋白具有良好的免疫原性反应，为鸡滑液囊支原体抗体检测试剂盒提供的包被抗原。

上述检测鸡滑液囊支原体的ELSIA试剂盒，其包括PYK蛋白包被的ELISA板，酶标二抗，阳性对照，阴性对照，洗涤液，样品稀释液，商品化的TMB和终止液的组分及配比如下：