[发明专利]一种检测鸡滑液囊支原体抗体的试剂盒及制备方法

权利要求书

1.一种检测鸡滑液囊支原体抗体的试剂盒，其特征在于，包括鸡滑液囊支原体PYK蛋白的ELISA板、酶标二抗、样本稀释液、洗涤液、封闭液、TMB、终止液、阳性对照及阴性对照血清。

2.根据权利要求1所述的一种检测鸡滑液囊支原体抗体的试剂盒，其特征在于，所述的酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡单克隆抗体；所述阳性对照为自然感染鸡滑液囊支原体的鸡血清；所述的阴性对照为正常鸡血清；所述洗涤液每升中含8.0g NaCl，0.22gKH₂PO₄，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，0.5mL Tween-20；所述封闭液为含5％马血清的洗涤液，样本稀释液为含5％的BSA的洗涤液；所述的终止液为2M的硫酸溶液。

3.根据权利要求1所述的一种检测鸡滑液囊支原体抗体的试剂盒，其特征在于，上述剂盒中所用的重组PYK蛋白的制备方法，其特征是人工合成鸡滑液囊支原体PYK蛋白的基因序列为模板扩增得到SEQ ID No.1所示的序列，将上述基因导入到原核表达载体PET-30a(+)中，获得重组表达载体；用重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，提取重组质粒，经PCR和酶切鉴定，筛选出阳性克隆PET-30a-pyk；将上述重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞诱导表达后，SDS-PAGE电泳分析表达蛋白，再采取Ni柱亲和层析方法，对目的蛋白进行纯化，然后分别用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白纯化结果，并分析PYK蛋白的抗原性。

4.根据权利要求3所述的一种检测鸡滑液囊支原体抗体的试剂盒，其特征在于，鸡滑液囊支原体PYK蛋白的制备，可以包括以下步骤：

1)扩增目的基因：以人工合成的鸡滑液囊支原体PYK蛋白基因序列为模板，通过PCR法对其pyk基因进行扩增、克隆得到目的基因，上游引物加BamH I酶切位点，下游引物加XholI酶切位点，引物如下：

pyk基因上游引物：5’-GGCTTGGATCCATGTATAAAGAAACCG-3’

pyk基因下游引物：5’-GCCCTCGAGTTGAACTGTATATTC-3’

2)Pyk基因回收以及PET-30a(+)质粒提取后用BamH I、Xhol I进行双酶切，回收目的片段，在T4DNA连接酶作用下降目的基因和载体按摩尔比5：1的比例在16℃下链接12-16小时，转化受态细胞DH5α，提取质粒，经BamH I、Xhol酶切鉴定正确后获得阳性重组表达质粒PET-30a-pyk

3)然后将提取质粒PET-30a-pyk转化BL21(DE3)感受态细胞，获得的阳性质粒菌于37℃培养，待A600值达到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后4小时的菌体，超声波破碎，离心后取沉淀进行SDS-PAGE电泳分析。

4)使用Ni-NTA进行亲和层析纯化，纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果表明1mmol/L的IPTG诱导4h，基因工程菌获得高效的表达，产生约57KD的特异性蛋白条带，与预测的分子质量相符；

ELISA分析纯化蛋白的抗原性。

5.根据权利要求1或3所述的一种检测鸡滑液囊支原体抗体的试剂盒，其特征在于，采用如下步骤制备所述的鸡滑液囊支原体PYK蛋白的ELISA板：用碳酸盐缓冲液作包被液，用上述包被液将稀释2.6μg/mL，按100μL/孔加入ELISA反应板中，37℃封闭1小时，4℃包被过夜，拍干，在用5％马血清37℃封闭1小时，以含0.05％吐温的PBST洗涤，拍干用铝膜真空封闭保存、备用。

6.根据权利要求1所述的一种检测鸡滑液囊支原体抗体的试剂盒，其特征在于，采用ELISA方法，检测鸡滑液囊支原体血清抗体，具体步骤为：

(1)封闭：向酶标版微孔中加入封闭液，每孔100μL，37℃封闭1h；

(2)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液300μL，洗涤3次并拍干；

(3)加样：向酶标版微孔中加入用样品稀释液1:200倍稀释后的待检测血清样品100μL，37℃封闭1h。

(4)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液300μL，洗涤3次并拍干；

(5)加酶标二抗：每孔加入稀释好酶标抗体工作液100μL，37℃孵育45min；

(6)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液300μL，洗涤3次并拍干；

(7)每孔加入TMB显色液，每孔100μL，37℃避光孵育10min；

(8)每孔加入终止液每孔100μL，立即在酶标仪上读取OD₄₅₀。