[发明专利]一种诱导神经干细胞的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种诱导神经干细胞的方法及组合物，利用所述方法和组合物可将外周血单个核细胞诱导形成神经干细胞。所述神经干细胞能表达神经干细胞相关基因，能分化出神经元，星形胶质细胞及少突胶质细胞。上述神经干细胞体外诱导分化形成的多巴胺能神经前体细胞，移植入PD小鼠模型纹状体内无肿瘤形成，可改善小鼠帕金森病模型的行为学，并能延缓帕金森疾病的进程。本发明提供的神经干细胞诱导及分化方法操作简单快速，创伤性小，安全性良好，有望用于治疗帕金森病。

技术领域

本发明涉及生物医药领域及神经干细胞技术领域，具体涉及一种利用非整合可升温灭活的仙台病毒载体诱导神经干细胞的方法及其定向分化的多巴胺能神经前体细胞在帕金森病细胞移植治疗的用途。

背景技术

干细胞移植为许多神经系统疾病的治疗带来希望，如帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、脑及脊髓外伤等。研究表明，使用胚胎干细胞来源的神经干细胞治疗以上疾病有一定作用，但胚胎干细胞的致瘤性，异体移植的免疫排斥以及伦理学争议限制其应用。由人成纤维细胞获得诱导多能干细胞(iPSCs)，并将其分化成神经干细胞用于移植治疗神经系统病变。然而研究发现，iPSCs用于临床治疗还面临很多问题，如致瘤性，定向分化效率低，安全性问题。近年来，将体细胞直接重编程为诱导神经干细胞(induced neural stemcells iNSCs)，而不经过iPSCs阶段，从而减少其致瘤性、提高分化效率，成为现在干细胞研究领域中的研究热点。

在诱导神经干细胞(iNSCs)的研究中，Ring等用逆转录病毒载体携带sox2转染人成纤维细胞,6-10天后就出现神经干细胞克隆，但是逆转录病毒基因序列能整合在宿主细胞的基因序列中导致宿主细胞基因突变。裴端卿等使用非整合质粒载体oriP/EBNA携带Oct4,Sox2,Sv40LT,Klf4和microRNA302-367电转人尿液中提取的活细胞，获得能表Sox1,Sox2,Pax6的神经干细胞，诱导的神经干细胞能分化成星形胶质细胞，多巴胺能神经元。张素春等利用仙台病毒携带外源Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc基因，转染人成纤维细胞后在含有LIF，SB431541，CHIR99021的神经干细胞培养基中培养13天后有神经干细胞克隆出现，这种诱导的神经干细胞可以分化出神经元，星形细胞，少突胶质细胞。但是，从人体获取成纤维细胞是有创伤的操作，成纤维细胞在转染前需在体外培养较长时间，而且，老年患者成纤维细胞不容易转染成功。

由此可见，现有技术中采用病毒载体或质粒载体诱导人成纤维细胞或尿液中提取的细胞时，存在如下问题。1.获取成纤维细胞创伤较大，体外培养成纤维细胞较难。2.细胞来源容易受到污染，如从尿液中获取细胞在操作过程中容易污染，特别是从病房获得尿液，更加容易污染。3.整合性病毒载体可能引起宿主细胞的基因突变。

帕金森病的细胞治疗近20年来一直受到广大医务工作者及生物学领域学者的关注，但目前没有报道用诱导神经干细胞分化而来的多巴胺能神经前体细胞进行移植治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用非整合载体将外周血单个核细胞诱导成为神经干细胞的技术，将神经干细胞定向分化为多巴胺能神经前体细胞治疗帕金森病，可改善帕金森病动物模型的行为学，可以对帕金森病进行细胞移植治疗。

本发明的第一方面提供了一种诱导神经干细胞的方法，所述方法包含以下步骤：(1)从外周血中提取单个核细胞并在单个核细胞培养基中扩增单个核细胞；(2)利用携带基因OCT4,SOX2,c-MYC,KLF-4的仙台病毒载体转染扩增后的单个核细胞；(3)将转染的单个核细胞接种到用Matrigel包被的细胞培养板上在神经干细胞培养基中培养，继续培养直至出现神经干细胞克隆；(4)取出神经干细胞克隆，进行神经干细胞扩增，期间将神经干细胞高温培养，获得仙台病毒被灭活的神经干细胞。

在一优选例中，所述单个核细胞是指外周血中使用Ficoll密度梯度离心法所得的中间云雾状的细胞层中所含的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞以及CD34+造血干细胞。

在另一优选例中，所述扩增后的单个核细胞主要是红系祖细胞。