[发明专利]一种诱导神经干细胞的方法及其应用

权利要求书

1.一种诱导神经干细胞的方法，所述方法包含以下步骤：(1)从外周血中提取单个核细胞并在单个核细胞培养基中扩增单个核细胞；(2)利用携带基因OCT4,SOX2,c-MYC,KLF-4的仙台病毒载体转导扩增后的单个核细胞；(3)将转导的单个核细胞接种到用Matrigel包被的细胞培养板上在神经干细胞培养基中培养，继续培养直至出现神经干细胞克隆；(4)取出神经干细胞克隆，进行神经干细胞扩增，期间将神经干细胞在38.5-39.5℃条件下培养一周至一个月，获得仙台病毒被灭活的神经干细胞；

所述单个核细胞培养基，其配方是基础培养基：49％Iscove’s modified Dulbecco’smedium(IMDM)，48％Ham’s F-12，1％胰岛素-转铁蛋白-硒，1％chemically defined lipidconcentrate，1％L-谷氨酰胺，0.05mg/ml左旋维生素C，5mg/ml牛血清蛋白BSA，0.018ul/ml硫代甘油；加入的细胞因子和化学小分子为：100ng/ml重组人干细胞因子，10ng/ml重组人白细胞介素3，2 U/ml促红细胞生成素，40ng/ml胰岛素样生长因子IGF-1，1μM地塞米松，100μg/ml全铁转铁蛋白；

所述神经干细胞培养基配方为：基础培养基为DMEM/F12和Neurobasal以1:1的比例混合,1×N2,1×B27,1％GlutaMAX，1％NEAA，加入的细胞因子和化学小分子为：10ng/ml重组人白血病抑制因子rhLIF、CHIR99021和SB431542。

2.如权利要求1所述的诱导神经干细胞的方法，其特征在于，所述单个核细胞为外周血中使用Ficoll密度梯度离心法所得的中间云雾状的细胞层中所含的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞以及CD34+造血干细胞。

3.一种神经干细胞，其特征在于，根据权利要求1或2所述的方法诱导获得。

4.一种诱导神经干细胞产生多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，根据权利要求1或2所述方法得到的神经干细胞，所述诱导过程分为第一和第二阶段，分别使用两种不同的培养基配方，所述第一阶段培养基配方I包括基础培养基为DMEM/F12,1×N2,1×B27,1％GlutaMAX，1％NEAA； 加入的化学小分子为：SAG1和FGF8，培养10天后将培养基更换为第二阶段培养基配方Ⅱ；所述的二阶段培养基配方包括基础培养基Ⅱ为DMEM/F12,1×N2,1×B27,1％GlutaMAX，1％NEAA；加入细胞因子和的化学小分子为：BDNF,GDNF,AA,DAPT,cAMP,TGFβⅢ，继续培养2周。

5.权利要求3所述的神经干细胞或权利要求4所述的方法产生的多巴胺能神经前体细胞在制备治疗脑神经损伤、脑卒中、脊髓损伤、帕金森病或肌萎缩性侧索硬化症药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，使用如权利要求4所述方法，选取神经干细胞诱导分化第10天到第13天的多巴胺能神经前体细胞。