[发明专利]一种高效的慢病毒生产体系及其生产方法

说明书

本发明提供一种高效的慢病毒生产体系及其生产方法，该慢病毒生产体系为由携带外源基因的载体质粒和3个包装质粒pLP1、pLP2‑rev、pLP‑VSVG构成的四质粒表达系统，包装质粒pLP1表达慢病毒的基本结构基因gag/pol，包装质粒pLP2表达慢病毒的调节基因rev，包装质粒pLP‑VSVG表达慢病毒的胞膜蛋白基因VSVG，其中，这四种质粒的比例为pLP1：pLP2：pLP‑VSVG：载体质粒＝9:6:9:8。利用本发明慢病毒生产体系及其生产方法，能够获得高达10⁹pfu/ml数量级的高滴度的病毒。

技术领域

本发明属于病毒制备领域，具体涉及一种高效的慢病毒生产体系及其生产方法。

背景技术

慢病毒属于反转录病毒科，慢病毒载体是基于HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)发展起来的基因治疗载体，可以将外源DNA或RNA有效地整合到分裂细胞和非分裂细胞的宿主染色体上，并形成稳定持久表达。与一般逆转录病毒载体相比，慢病毒载体具如下优点：有可感染分裂细胞及非分裂细胞的特点，包括较难转染的原代细胞、干细胞等；转移基因片段容量较大，目的基因表达时间长；安全性高，不易诱发宿主免疫反应。因此在基因治疗层面，慢病毒载体正获得越来越广泛的应用。

HIV-1型慢病毒核心为单股正链RNA二倍体，由9个基因组成，包括3个编码病毒颗粒的基本结构基因—gag、pol、env，2个调节基因—tat、rev以及4个辅助基因vif、vpr、vpu、nef。其中gag基因编码病毒核心蛋白，pol基因编码病毒复制需要的酶，env基因编码病毒胞膜糖蛋白。

HIV-1型慢病毒载体是由HIV-1型慢病毒改造而成的，经历了30年的改进更迭，目前应用广泛的是4质粒表达系统，系统由携带外源基因的载体质粒和3个包装质粒构成，特点如下：首先，为了确保载体的生物安全性，防止产生具有复制能力的病毒，将包装质粒部分基因进行了替换，并所需要的基因分散到3个质粒中，一个表达gag/pol，一个表达胞膜蛋白，一个表达rev；第二，将载体3’端长末端重复序列中U3区的增强子和启动子序列去除，确保了载体一旦转入细胞将不能产生完整长度的RNA，丧失了转录能力，从另一个维度减少产生具有复制能力的病毒的可能性；第三，删除了vif、vpr、vpu、nef 4个致病基因，去除了对细胞潜在的毒害作用，提高转染后细胞活性；第四，使用VSV-G基因替代env表达胞膜结构，从而扩大了载体的感染谱，使载体的具有高度稳定性。

这4个质粒分别具有不同基因区段，尤其是包装质粒为需要配合使用共同转染到目的细胞中，但使用比例和用量众说纷纭，相差很大，并没有定论。而商业化包装质粒多以混合物形式出售，也没有明确的比例。而且研究表明，在实际应用过程中，随着插入片段的延长，病毒滴度呈半对数形式下降，目的质粒越长则包装活力毒粒的能力越下降。因此出于应用需要，优化确定一套稳定而高滴度的慢病毒生产体系十分重要。

在非专利文献1中，通过对比包装病毒的感染效率，优化了慢病毒包装的混合质粒条件，并成功地应用于感染白血病细胞系，首次发现提高Rev质粒量可以更有效地提高慢病毒的包装效率。发现相对低剂量的pLP-VSVG和相对高剂量的pLP2-Rev是优化第三代慢病毒包装体系的重点。

然而本发明的发明人通过研究发现，慢病毒包装时载体质粒和包装质粒以与现有技术不同的其他比例使用时也能够获得非常优异的效果。

现有技术文献

非专利文献1：阮峥等，“第三代慢病毒包装系统优化及Rev表达质粒对慢病毒包装效率作用初探”，生物技术通讯Vol25，No.6，Nov.,2014，第770-774页

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供一种高滴度的慢病毒生产体系及其生产方法，

用于解决课题的方法