[发明专利]构建目的序列DNA文库的试剂盒及目的序列DNA文库的构建方法

权利要求书

1.一种构建目的序列DNA文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

目的序列扩增试剂，用于从待测样本中扩增目的序列得到第一样本，所述目的序列扩增试剂包括目的序列扩增反应液，所述目的序列扩增反应液包括1U/mL～5U/mL的DNA聚合酶、300mM～500mM的KCl、10mM～15mM的MgCl₂及8mM～12mM的dNTPs，所述待测样本为FFPE样本；

消化试剂，用于去除所述第一样本中的引物得到第二样本，所述消化试剂由如下组分构成：0.2U/uL～2U/uL的UDG酶、0.2U/uL～5U/uL的Fpg酶、0.2U/uL～4U/uL的聚合酶及0.2U/uL～2U/uL的T4多聚核苷酸激酶，所述聚合酶选自T4 DNA聚合酶与Klenow片段中至少一种；及

连接试剂，用于对所述第二样本接上接头得到目的序列DNA文库，所述连接试剂包括连接反应液，所述连接反应液包括100U/μL～500U/μL的T4 DNA连接酶、体积百分含量为5％～15％的PEG6000、体积百分含量为10％～15％的甘油、体积百分含量为2％～10％的1,2-丙二醇、8mM～12mM的KCl、0.5mM～2mM的ATP及1nM～3nM的dNTPs。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述连接试剂还包括P1接头，所述P1接头包括P1接头的正向序列及P1接头的反向序列，所述P1接头的正向序列的碱基序列如SEQID No.1所示，所述P1接头的反向序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述连接试剂还包括标签接头，所述标签接头包括标签接头的正向序列及标签接头的反向序列，所述标签接头的正向序列的碱基序列如SEQ ID No.3所示，所述标签接头的反向序列如SEQ ID No.4所示。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述目的序列DNA文库扩增试剂包括PCR正向扩增引物及PCR反向扩增引物，所述PCR正向扩增引物的碱基序列如SEQ ID No.37所示，所述PCR反向扩增引物的碱基序列如SEQ ID No.38所示。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述目的序列DNA文库扩增试剂还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括1U/μL～5U/μL的热启动高保真DNA聚合酶、18mM～22mM的(NH₄)₂SO₄、1mM～3mM的MgSO₄及220μM～240μMdNTPs混合液，且所述PCR反应液的pH为7.0～7.6。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述目的序列为肿瘤驱动基因。

7.一种目的序列DNA文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

采用目的序列扩增试剂对待测样本进行多重PCR扩增反应得到第一样本，所述目的序列扩增试剂包括目的序列扩增反应液，所述目的序列扩增反应液包括1U/mL～5U/mL的DNA聚合酶、300mM～500mM的KCl、10mM～15mM的MgCl₂及8mM～12mM的dNTPs，所述待测样本为FFPE样本；

将所述第一样本与消化试剂反应得到第二样本，所述消化试剂由如下组分构成：0.2U/uL～2U/uL的UDG酶、0.2U/uL～5U/uL的Fpg酶、0.2U/uL～4U/uL的聚合酶及0.2U/uL～2U/uL的T4多聚核苷酸激酶，所述聚合酶选自T4 DNA聚合酶与Klenow片段中至少一种；及

将所述第二样本与连接试剂反应，得到目的序列DNA文库，所述连接试剂包括连接反应液，所述连接反应液包括100U/μL～500U/μL的T4 DNA连接酶、体积百分含量为5％～15％的PEG6000、体积百分含量为10％～15％的甘油、体积百分含量为2％～10％的1,2-丙二醇、8mM～12mM的KCl、0.5mM～2mM的ATP及1nM～3nM的dNTPs。