[发明专利]一种含有叶绿体转运肽的基因序列的应用

说明书

本发明公开了一种含有叶绿体转运肽的基因序列的应用。通过构建含有叶绿体转运肽序列的磷脂：二酰基甘油酰基转移酶基因表达载体，转化至野生型莱茵衣藻中并进行过表达，强化衣藻TAG合成能力，同时达到TAG积累与微藻生长同步化的目的。本发明将这种转基因衣藻通过正常TAP培养基培养，总脂肪酸含量和TAG积累分别提高22％和32％，实现了蛋白表达和油脂积累与生长同步化的目标，这将对生物能源有着重要作用，在微藻生物工程领域具有显著的应用前景。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及将目的基因转入莱茵衣藻基因组中，强化莱茵衣藻脂肪酸积累并与生长同步化，尤其强化了总脂肪酸以及TAG的积累，涉及一种含有叶绿体转运肽的基因序列的应用。

背景技术

微藻一直是作为生物柴油的一个有吸引力的潜在来源，它是一个在真核生物中很好的模型，用它来研究通过多途径合成甘油三酯(TAG)。为了获得更多的 TAG，在微藻中通常采用胁迫条件的培养方式，胁迫状态会限制藻细胞的生长，所以总体TAG的产率是有限的。经过大量的实验，仍然不能实现TAG的积累和藻细胞生长的同步化。为了有效积累TAG，实现TAG积累与藻细胞生长同步化被认为是未来理想策略的特征之一。

为了提高TAG的产率，除了工程类手段，其中另一种方式是：采用分子生物学的手段，修饰微藻中与TAG合成有关的基因。现在，大部分的研究者集中在对酰基转移酶基因的修饰，例如甘油三磷酸酰基转移酶(GPAT,EC 2.3.1.15)，溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT,EC2.3.1.51)，酰基转移酶：基转移酶(DGAT,EC 2.3.1.20)和磷脂：酰基甘油酰基转移酶(PDAT,EC 2.3.1.158)。在上面的酰基转移酶中，PDAT是唯一一种不依赖酰基CoA，而是通过磷脂的酰基作为供体合成 TAG的酰基转移酶，这一结论是Anders和他的同事在蓖麻中第一次确定的 (Dahlqvist A et al.2000)。在那之前，DGAT被认为是在DAG到TAG的合成过程中唯一的酶，而且认为酰基CoA是合成过程中不可缺少的。

在Anders等人提出关于PDAT这一新观点后，更多的研究者集中研究PDAT，研究来源中不同物种中PDAT的功能并且进一步去指导TAG的生产，例如，张等人(Chisti Y.etal.2007)研究结果表明：在拟南芥中，PDAT1影响花粉和种子的正常发育和生长；并且Yoon等人(Yoon K et al.2012)指出CrPDAT具有广泛的底物特异性和不同种脂肪酶功能，CrPDAT能够水解糖脂，极性脂和中性脂，胆固醇脂(类似于LCAT功能)，CrPDAT更倾向于作用于带负电的磷脂(PA/PS/PI/PG)。而其他来源的PDAT，包括LuPDAT/ScPDAT/AtPDAT，更去倾向于使用带正电的磷脂(PC/PE)作为酰基供体。该研究结果也展现了CrPDAT 的重要性。

通过对比莱茵衣藻和其他物种的PDAT序列，发现ScPDAT(GenBank: NM_001183185)和CrPDAT有高度的相似性，相似度达到35％。通过序列比对分析，CrPDAT有2个独特的GAP区，GAP1(570-700)带有14个连续不断的SG 重复序列，GAP2(840-930)带有30个氨基酸残基A和13个G。在这里，我们将ScPDAT看作是CrPDAT去掉GAP区后的突变体，因此将ScPDAT过表达在莱茵衣藻中。这一研究将会有助于探索PDAT在TAG积累机制中的调节功能。

与胞质蛋白不同，核编码的叶绿体蛋白需要经过叶绿体转运肽(chloroplasttransit peptide，cTP)的帮助定位并正确折叠于叶绿体内进而发挥功能，所以，对于外源基因，还需要在其功能域上游插入叶绿体转运肽片段。

发明内容

本方法的目的就是一种与生长同步化的提高微藻油脂积累的方法。

为实现上述目的，本发明提供一种能够定位于叶绿体的磷脂二酰基甘油酰基转移酶基因和表达载体，转化重组表达载体得到转基因衣藻，该转基因衣藻提高脂肪酸积累并与生长同步化。