[发明专利]Cap-TFlg蛋白在制备PCV2疫苗中的应用

权利要求书

1.Cap-TFlg蛋白在制备PCV2疫苗中的应用，所述疫苗能够使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，能够有效抵抗强毒株的攻击，提高仔猪的存活率。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疫苗包含Cap-TFlg蛋白和佐剂。

3.根据权利要求1或2中所述疫苗的制备方法，其是将Cap-TFlg蛋白与ISA206佐剂按照质量比1:1进行配苗制备得到。

4.根据权利要求3中所述的疫苗的制备方法，其特征在于，编码所述Cap-TFlg蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.2。

5.根据权利要求4中所述的疫苗的制备方法，其特征在于，其是将核苷酸序列为SEQ IDNo.2转化进大肠杆菌进行原核表达制备得到。

6.根据权利要求5中所述的疫苗的制备方法，其特征在于，制备Cap-TFlg蛋白的方法包括如下步骤：

步骤一，Cap-TFlg基因人工合成，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，5’端带有Nco I酶切位点，3’端带有Hind III酶切位点；

步骤二：以pET-28α载体为骨架，使用Nco I和Hind III酶切并回收骨架片段，Cap-TFlg片段使用Nco I和Hind III酶切并回收，然后通过连接酶于16℃连接过夜，将连接产物转化入EZ10大肠杆菌感受态细胞中，最终挑取菌落溶于10µL培养基中用于菌落PCR鉴定，将阳性重组子提质粒并酶切鉴定以及测序，最终获得转移载体pBac-Cap3；

步骤三，将预表达鉴定为阳性的菌种转接于200ml LB加抗生素（如kana抗生素，则终浓度50ug/ml）的容量为1000ml的大锥形瓶中培养，转接比例是1:100，培养条件：37℃，200rpm/min培养3~4小时；

步骤四：当OD600值达到0.4~0.6时，加乳糖至终浓度1%，开始诱导表达，诱导表达的条件：37℃，160rpm/min培养6小时；

步骤五：用200ml 离心杯收集菌体，6000rpm，4℃离心10分钟，弃上清；

步骤六：加50ml缓冲液于离心杯中，用5ml枪头反复吹打，使细胞均匀分散在缓冲液中，所述缓冲液为20mmol/L Tris HCl，0.5mol/L NaCl，pH7.9；

步骤七：将重悬均匀的菌体进行匀质机破菌，破菌条件：功率850w；破菌2分钟；

步骤八：将破菌好的菌体离心，8000rpm，4℃离心15分钟，分离上清和沉淀；

步骤九：将沉淀物用50ml缓冲液重悬于50ml离心管中，所述缓冲液为20mmol/L TrisHCl，0.5mol/L NaCl，pH7.4；

步骤十：分别取40μL上清和40μL重悬的沉淀，加10μL 5×蛋白上样缓冲液，100℃加热10分钟，取10μL煮好的样品进行SDS-PAGE电泳检测，即得到所述的Cap-TFlg蛋白。