[发明专利]一种线性扩增双链DNA的方法及应用

说明书

本发明的目的之一是提供一种线性扩增双链DNA的方法，使用该方法可以快速稳定的将目标DNA进行线性转录为RNA，以实现线性扩增，并通过逆转录方法转化为DNA文库。本发明的目的之二是提供一种肿瘤低频率突变检测的应用，使用该应用可以检测低于1%的低水平突变。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供了一种线性扩增双链DNA的方法，具体通过在双链DNA一端连接RNA聚合酶识别的启动子序列，继而使用RNA聚合酶扩增为大量RNA，并逆转录成DNA。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种线性扩增双链DNA的方法及其应用。

背景技术

在自然界，基因突变是经常发生的，突变如果发生在与细胞增殖有关的基因，就可能导致细胞摆脱正常的生长控制，表现出恶性细胞的表型性状。许多致癌物都是致突变物。它们大多数能引起DNA的损伤。这些损伤可以修复，也可以导致细胞死亡。如果DNA的修复不正常，细胞虽可继续存活，但却成了潜在的癌细胞。

对肿瘤细胞突变的检测主要技术难点在于肿瘤突变的频率很低，尤其是当突变频率在低于1%时，容易由PCR扩增系统产生的误差导致检测不准确。

而针对这个技术难点，较为常见的方法有数字液滴PCR技术和深度测序技术。深度测序技术包括捕获测序与线性扩增和分子标签技术。数字液滴PCR技术是通过将每个DNA模板分散到单独的液滴中进行扩增检测，检测灵敏度高，准确性好，但是检测位点通量较少。捕获测序是通过设计目标区域的探针，针对性的捕获靶向区域；目前的线性扩增方法主要是将待检的DNA形成单链结构，通过接头、或环化酶的作用将单链DNA连接成环，此方法成环效率低，步骤繁琐，反应条件要求严格。分子标签技术是通过在PCR扩增中对原始模板初级产物添加唯一的标签序列，但是缺点也没明显，要合成含有百万种以上的分子标签的相同引物，价格昂贵，且在扩增中容易丢失不完整扩增子的DNA片段，导致检测信息丢失，扩增过程中因扩增偏好性，产物扩增水平不一致。

因此，寻找一种检测通量高，成功率高，检测准确，可靠、经济、快速的技术尤为重要

发明内容

本发明的目的之一是提供一种线性扩增双链DNA的方法，使用该方法可以快速稳定的将目标DNA进行线性转录为RNA，以实现线性扩增，并通过逆转录方法转化为DNA文库。

本发明的目的之二是提供一种肿瘤低频率突变检测的应用，使用该应用可以检测低于1%的低水平突变。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种线性扩增双链DNA的方法，具体通过在双链DNA一端连接RNA聚合酶识别的启动子序列，继而使用RNA聚合酶扩增为大量RNA，并逆转录成DNA。

进一步，所述的双链DNA末端为平末端，或特定的粘性末端，如3’A结构。

进一步，所述的RNA聚合酶识别的启动子序列可以为T7 RNA聚合酶启动子序列、T3RNA聚合酶启动子序列，SP6 RNA聚合酶启动子序列等。

进一步，所述的逆转录是指通过逆转录酶，及特异性通用引物，将扩增产生的RNA为模板转化为DNA序列。

进一步，所述的特异性通用引物为特定的核苷酸序列。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种线性扩增双链DNA的方法，使用该方法可以纠正因PCR扩增系统误差导致低水平突变检测不准确的问题，且扩增效率高，操作简单，成本低，便于应用于肿瘤突变DNA的检测，尤其是游离肿瘤DNA。

附图说明

图1是双链DNA线性扩增步骤示意图。

具体实施方式