[发明专利]一种獭兔皮肤真皮毛乳头细胞分离培养方法

说明书

本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其是一种獭兔皮肤真皮毛乳头细胞分离培养方法。该獭兔皮肤真皮毛乳头细胞分离培养方法包括:(1)取獭兔背部皮肤，剪成长条，置于Ⅱ型分离酶溶液中，于4℃过夜消化，次日于37℃培养箱中消化后，去除表皮；(2)将经步骤(1)去除表皮处理后剩余的皮肤真皮部分剪碎成泥，置于D型胶原酶中消化4‑6h，至消化皮肤呈液态并在显微镜下观察有毛乳头游离出，用含胎牛血清的DMEM终止消化；(3)将经步骤(2)处理后的液态皮肤离心，收集细胞，弃去上清液，细胞培养基重悬，即得。相比于现有技术，该分离培养方法科学、合理，培养成功率高且分离过程中无细胞机械损伤。

技术领域：

本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其是一种獭兔皮肤真皮毛乳头细胞分离培养方法。

背景技术：

毛发附着在皮肤的外表面，不仅对动物和人具有防御和保护功能，还具有增加信息交流和美观的作用(Messenger，1993)。毛发由毛囊生成，毛囊(Hair follicle)是表皮向真皮凹陷后形成的能控制毛发生长的皮肤附属器官，是由胚胎期神经外胚层与间充质相互作用，最终发育形成的由多层细胞组成的、具有合成多种特异角质蛋白功能的复杂的动态器官，具有独特的结构和周期性再生(即经历生长期、衰退期和休止期的周期性循环)的特性。毛囊在形成与分化过程中，至少涉及到20种不同的细胞群，主要有毛乳头、毛母质、内根鞘、外根鞘等细胞组成。

由于毛囊具有周期性生长的特性，为组织再生提供了良好的模型。毛囊的周期性生长由毛囊干细胞介导发生，毛囊干细胞的静息与活化受到干细胞微环境的调控(Paus等，2004)。毛囊干细胞位于毛囊隆突区，但目前人们对影响毛囊干细胞自我更新和分化的微环境了解并不多、更不彻底。其中，由休止期向生长期的转化，也就是生长期的启动是毛囊生长最关键的环节。当毛囊的周期性再生功能发生障碍时，就会出现脱发、斑秃等毛囊疾病。Jahoda等2011报道，将毛乳头细胞制成微囊植入大鼠耳部皮下，能够诱导耳毛囊再生，并有将人的毛乳头细胞条件培养液用于临床斑秃的治疗。随着社会的发展，人们对具有保护与美观作用的毛发越来越重视，对毛囊周期性再生的研究越来越重要。

毛乳头(Dermal papilla)是毛囊真皮成分中最重要的部分，在毛囊中控制着毛囊发育、生长和重建，并在一定程度上决定了毛囊的大小。毛乳头细胞是真皮中的一群特异化的间充质来源的细胞，在毛囊周期变化过程中发挥关键作用，是整个毛囊中直接参与毛囊生长周期调控的关键组分。大量研究表明，在动物毛囊周期生长中，毛乳头细胞与毛囊干细胞发生定期规律性的信号交流，在毛囊周期启动中最为密切(Millar，2002；Aoi等，2012；Hill等，2013)，说明毛乳头细胞可为毛囊干细胞提供微环境支持，并在毛囊周期性再生的起始阶段发挥作用。毛乳头是一个分泌因子的中心，可以生成大量的信号因子，通过激活或抑制毛囊周期性生长信号通路发挥调节作用(Peus等，1996；Roh等，2004；Dipo等，2005)。

然而，由于毛乳头位于毛囊的基底部，体积小、又被毛囊包裹，因此分离困难。目前，在毛乳头的分离过程中最常用的方法主要是显微解剖法，此方法对仪器设备及无菌环境要求较高，需要操作者拥有较熟练的显微分离技术，工作强度大，耗时较长，同时获得的毛乳头细胞贴壁率较低，毛乳头细胞迁出困难。此外，显微解剖分离法可以分离触须毛囊、小鼠皮肤毛囊、山羊皮肤毛囊等较大的毛囊，而对于像獭兔皮肤毛囊数量多，个体小的毛囊毛乳头的分离并不适用，分离困难；另外机械分离造成毛乳头细胞损伤，细胞贴壁率低，培养獭兔真皮毛乳头细胞成功率不高。因此，获取獭兔皮肤毛囊毛乳头细胞不仅成为研究獭兔毛囊周期性生长变化、影响因素及调控机制的关键素材，为提高獭兔皮张质量的育种改良奠定基础，也还可以为医学领域的人类毛发再生研究提供模型。

发明内容：