[发明专利]筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子及其筛选方法

说明书

本发明涉及一种筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子及其筛选方法，该酵母转化子含有桑树β亚基和γ亚基的编码基因；将桑树cDNA文库转化至获得能同时表达β和γ亚基的酵母转化子中，最后利用His和Met两种营养缺陷筛选而得到与βγ二聚体相互作用的阳性克隆，最后成功筛选到与桑树G蛋白βγ二聚体互作的蛋白。该方法可高效筛选蛋白二聚体互作蛋白，并成功地应用于桑树G蛋白βγ二聚体互作蛋白的筛选。

技术领域

本发明属于遗传生物技术领域，涉及筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子；还涉及筛选方法和应用。

背景技术

蛋白质与蛋白质之间相互作用是指两个或两个以上的蛋白质分子通过非共价键形成蛋白质复合体而行使功能，该过程是构成细胞生化反应网络的一个主要组成部分。目前用于研究蛋白质相互作用的方法包括酵母双杂交系统、噬茵体展示技术、等离子共振技术、荧光能量转移技术、抗体与蛋白质阵列技术、免疫共沉淀技术和pull-down技术等。其中酵母双杂交系统是最为快速和直接的蛋白质互作研究的方法，其基本原理是：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域DNA结合域(DNA-BD)和转录激活域(AD)。正常条件下，BD不能与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait-BD)和prey融合蛋白(prey-AD)，如果bait和prey发生相互作用，就会促使BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。酵母双杂交技术还应用于对目标蛋白的未知互作蛋白的大规模筛选中，相较于其它筛选方法，具有筛选量大、效率高及应用广泛等优点。

在细胞中，有些蛋白不能单独行使功能，而是通过与其他蛋白质形成聚合体后才能与其下游蛋白结合，如三聚体G蛋白由α、β和γ亚基组成，在失活的情况下，三种亚基以三聚体的形式存在，不能传递信号，而当G蛋白被激活后，三聚体发生解离，其中β和γ亚基仍然保持着二聚体的形式行使功能。为筛选和鉴定βγ二聚体的下游信号元件，研究者通常是鉴定与β和γ亚基单独互作的蛋白，并不能完全反映βγ二聚体的功能。因此，开发一种筛选与蛋白二聚体相互作用的蛋白质的方法是比较迫切的需要。

酵母三杂交技术由酵母双杂交技术开发而来，与酵母双杂交一样，也利用了转录激活子调控真核基因转录的特点。不同的是，酵母三杂交研究了两个蛋白与第三个成分之间的相互作用，第三个分子包含了蛋白质。目前还没有太多关于大规模筛选蛋白二聚体如βγ二聚体的互作蛋白的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子；本发明的目的之二在于提供利用所述酵母转化自筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子，包括如下步骤：

1)将桑树β亚基和γ亚基的编码基因分别插入到将pBridge载体的MCS I和MCSII，重组质粒pBridge-βγ；

2)将步骤1)获得的重组质粒pBridge-βγ转化AH109酵母中，获得筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子。

优选的，所述γ亚基为γ1亚基或γ2亚基。

2.利用所述酵母转化自筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的方法，包括如下步骤：提取桑树RNA，反转合成cDNA，然后连接线性化的pGADT7载体，形成桑树文库质粒，然后将桑树文库质粒转入所述酵母转化子中，用SD-Trp-Leu-His-Met+5mM 3AT筛选阳性克隆子，然后阳性克隆中提取质粒，转化大肠杆菌后测序、分析得到与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质。

优选的，所述桑树文库的文库库容大于3×10⁶CFU ml^-1，平均插入片段大于1200bp，阳性率为100％。