[发明专利]一种工程菌及其在丹参素和α-酮戊二酸联产中的应用

说明书

本发明公开了一种工程菌及其在丹参素和α‑酮戊二酸联产中的应用，属于生物工程技术领域。本发明构建了一种新型的三酶共表达基因工程菌，该菌可应用于光学纯的3‑(3,4‑二羟基苯基)‑2‑羟基丙酸的生产。本发明选择的(D/L)‑α‑羟基羧酸脱氢酶均具有底物专一性差，光学专一性强的特点，可生产光学纯的D‑丹参素和L‑丹参素，同时联产α‑酮戊二酸。进一步地，通过敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解，提高了重组菌的生产效率。利用本发明的重组菌转化生产丹参素和α‑酮戊二酸的方法简单且原料易得，杂质少,具有良好的工业化应用前景。

技术领域

本发明涉及一种工程菌及其在丹参素和α-酮戊二酸联产中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

提取自丹参的丹参素，学名R-(+)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸、D-(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酸，英文名为：Danshensu、D-DSS、R-DSS、(R)-(+)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-lactic acid、(R)-(+)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoic acid，是一种右旋酚酸类化合物。目前不存在天然的左旋丹参素。

丹参素是丹参水提液中的重要有效成份，国内于1980年从丹参水提液中得到并鉴定了结构(丹参水溶性有效成分的研究，Ⅱ.D(+)β(3,4-二羟基苯基)乳酸的结构，上海第一医学院学报，1980，05(7)，384-385)，各种研究表明丹参素具有重要的药理药效作用，在心脑血管疾病的治疗等方面具有独特治疗作用。

当前丹参素主要从丹参中提取得到(专利CN200810038853.9)。丹参素在丹参中的含量较低，并且丹参素种植成本高且产量有限，因此当前丹参素不仅价格高而且远远无法满足市场的需求。专利CN201310559498.0提出了一种构建大肠杆菌基因工程菌利用葡萄糖发酵产丹参素的方法，由于合成代谢途径涉及利用羟基化酶，该酶很容易使代谢过程产物氧化而影响丹参素的产率，同时由于大肠杆菌发酵是高耗氧过程，也会氧化丹参素，因此当前该方法产率较低，成本将会高于植物提取过程。专利CN201210190171.6提出了水解丹酚酸B生产丹参素的方法，丹酚酸B需从丹参提取，并且化学水解过程有大量副反应，同样不适用于规模化生产。手性合成丹参素(专利CN201210420488.4)的催化剂极为昂贵，当前也仅停留在实验室水平。

早在1988年Roth等人提出了先以化学法处理左旋多巴得到对应的3,4-二羟基苯丙酮酸，再酶法合成S-(+)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸(S-DSS，L-DSS)的方法(Enzymatic Synthesis of(S)-(-)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)lactic Acid，Arch.Pharm.(Weinheim)321，179-180(1988))。Z.Findrik，等人采用蛇毒氨基酸氧化酶将左旋多巴转化成3,4-二羟基苯丙酮酸，然后再用D-乳酸脱氢酶还原生成D-(3,4-二羟基苯基)乳酸(Modelling and Optimization of the(R)-(+)-3,4-dihydroxyphenyllactic AcidProduction Catalyzed with D-lactateDehydrogenase from Lactobacillusleishmannii Using Genetic Algorithm，Chem.Biochem.Eng.Q.19(4)351–358(2005))。这两种方法制备3,4-二羟基苯丙酮酸中间体的成本较高，且操作复杂。

发明内容

基于目前各种方法的缺陷，本发明提供了一种光学纯的丹参素与α-酮戊二酸联产的生产方法，并构建了多酶共表达的工程菌，实现了丹参素的高效生产。本发明所要解决的技术问题是提供一种能低成本生产丹参素的重组菌。同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。