[发明专利]一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法

说明书

本发明公开了一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其包括如下步骤：(1)溶液配制：包括样品溶液的配制、阳性对照品溶液配制、阴性对照溶液的配制、荧光生成反应液的配制；(2)微阵列芯片的制备：将对照品溶液和样品溶液点于薄层预制硅胶板上；(3)荧光猝灭图像的获取：取微阵列芯片，荧光生成反应液雾化，置于薄层图像观察仪中，曝光，采集图像；(4)数据处理：采集的图像导入TLC分析软件中进行像素分析；该方法具有样品前处理简单、通量高、成本低廉的优点；反应体系为荧光自发光系统，不会受样品本身颜色和外界光源的干扰，具有良好的专属性。

技术领域

本发明属于药物技术领域，公开了一种基于荧光猝灭原理的抗氧剂高通量筛选方法，用于抗氧剂的筛选、追踪及总抗氧化活性评价。

背景技术

关于人类的生老病死，自由基衰老理论是较为被人们接受的理论之一。该理论认为，衰老过程中的退行性变化是由于细胞正常代谢过程中产生的自由基的有害作用造成的。生物体系中的自由基主要以活性氧的形态存在，包括超氧阴离子(O₂^.-)，羟基自由基(OH^.-)，双氧水(H₂O₂)等，它们是线粒体在有氧代谢过程中产生的副产物。活性氧具有高反应活性，对机体的组织、蛋白、DNA造成氧化损伤。损伤的累积会造成细胞和组织功能损伤或丧失，从而引起衰老和疾病。在生理情况下，机体内部的抗氧化系统能够清除过量的自由基从而使机体免受其伤害，达到一种氧化还原平衡状态。但在病理状况下，过量自由基的产生或抗氧化系统的失职将令机体处于一种氧化应激的状态，进而引起老化和一些退行性疾病。研究发现，外源性的抗氧剂可以阻止自由基链式反应而改变机体的氧化应激状态。绝大多数疾病与过量自由基的产生息息相关，除了少数遗传性疾病。外源性抗氧剂的补充可以大大改善患者的健康状况。最新有研究显示，甚至在出生之前补充抗氧剂也可延缓衰老。目前以“antioxidant supplement”为关键词在ClinicalTrials.gov网站上搜索到的抗氧化补充剂的临床试验多达1000多项。目前常用的抗氧剂有维生素类(C和E)，微量元素，黄酮类和酚酸类等，诸多临床试验的效果并不尽如人意，原因可能与部分抗氧剂可能会引起炎症反应有关，因此，筛选出即具有强抗氧化活性又具有较好抗氧活性的抗氧剂显得尤为迫切。

目前为止，高通量筛选抗氧剂的方法主要有96孔板法和流动注射法。复杂的样品处理过程和昂贵的精密仪器使得这些方法不仅效率低下，而且难以普及。因此，需要寻找一种简便经济的快速筛选抗氧剂的方法，并同时追踪及评价抗氧剂活性的方法。

发明内容

发明人在研发过程中发现鲁米诺作为一种荧光底物被广泛应用于刑事侦查，即使用水冲洗过犯罪现场，残留的血迹中微量的铁离子仍然可以催化鲁米诺的氧化还原反应，发出425nm的荧光用于辨认血迹。受此启示，如若有抗氧剂的存在，将与鲁米诺竞争性的抢夺氧化剂，从而降低荧光的强度。为此，我们以预制硅胶G板作为芯片载体，将样品以微阵列的形式加载于芯片上。然后依次以双氧水和鲁米诺半定量地雾化。理论上来讲，整个芯片表面应产生蓝色荧光，而具有抗氧化能力的样品点样处则会产生荧光强度的减弱。然而这样产生的荧光强度太弱，不足以被普通的图像采集设备捕获到。我们利用一种高效催化剂-铁氰化钾，大大提高了荧光效率，使得反应产生的荧光肉眼可见，且持续20～30s的时间，可以进行图像捕获进行进一步的像素分析。

本发明建立的一种基于荧光猝灭原理的抗氧剂高通量筛选方法，具有样品前处理简单、通量高、成本低廉的优点。本发明的方法中反应体系为荧光自发光系统，不会受样品本身颜色和外界光源的干扰，具有良好的专属性。

本发明是通过下述技术方案实现的：

一种基于荧光猝灭原理的对药材中抗氧剂高通量筛选方法，其包括如下步骤：

步骤1，溶液配制：

步骤2、微阵列芯片的制备：

步骤3、荧光猝灭图像的获取：